ڈبل پھنسے ہوئے RNA (dsRNA) ELISA KIT

یہ کٹ ایک اینزائم لنکڈ امیونوسوربینٹ پرکھ (ELISA) ہے جو بایوٹین-اسٹریپٹاویڈن سسٹم کے ساتھ جوڑتی ہے، ترتیب سے قطع نظر، 60 بیس جوڑوں (bp) سے زیادہ لمبائی کے ساتھ dsRNA کی مقداری پیمائش کے لیے۔پلیٹ کو اینٹی ڈی ایس آر این اے اینٹی باڈی کے ساتھ پہلے سے لیپت کیا گیا ہے۔نمونے میں موجود dsRNA کو شامل کیا جاتا ہے اور کنویں پر لیپت اینٹی باڈیز سے منسلک ہوتا ہے۔اور پھر بایوٹینیلیٹڈ اینٹی dsRNA اینٹی باڈی کو شامل کیا جاتا ہے اور نمونے میں dsRNA سے منسلک ہوتا ہے۔دھونے کے بعد، HRP-Streptavidin شامل کیا جاتا ہے اور Biotinylated anti-dsRNA اینٹی باڈی سے منسلک ہوتا ہے۔انکیوبیشن کے بعد انباؤنڈ HRP-Streptavidin دھل جاتا ہے۔پھر TMB سبسٹریٹ محلول کو HRP کے ذریعے شامل کیا جاتا ہے اور ایک نیلے رنگ کی پروڈکٹ تیار کرنے کے لیے کیٹالائز کیا جاتا ہے جو تیزابی سٹاپ محلول شامل کرنے کے بعد پیلے رنگ میں تبدیل ہو جاتا ہے۔پیلے رنگ کی کثافت پلیٹ میں پکڑے گئے dsRNA کی ہدف کی مقدار کے متناسب ہے۔جذب 450 nm پر ماپا جاتا ہے۔

درخواست

یہ کٹ بقایا dsRNA کی مقداری پیمائش کے لیے ہے۔

کٹ کے اجزاء

اسٹوریج اور استحکام

1. غیر استعمال شدہ کٹ کے لیے: پوری کٹ کو شیلف لائف میں 2~8℃ پر محفوظ کیا جا سکتا ہے۔سٹوریج کے استحکام کے لیے مضبوط روشنی سے گریز کرنا چاہیے۔

2. استعمال شدہ کٹ کے لیے: مائیکرو پلیٹ کھولنے کے بعد، براہ کرم غیر استعمال شدہ کنوؤں کو پلیٹ سیلر سے ڈھانپیں اور فوائل پاؤچ پر واپس جائیں جس میں ڈیسیکینٹ پیک ہو، فوائل پاؤچ کو زپ کریں اور استعمال کے بعد جلد از جلد 2~8℃ پر واپس جائیں۔دیگر ریجنٹس کو استعمال کے بعد جتنی جلدی ممکن ہو 2~8℃ پر واپس کر دیا جائے۔

مواد درکار ہے لیکن فراہم نہیں کیا گیا۔

1. 450±10nm فلٹر کے ساتھ مائیکرو پلیٹ ریڈر (اگر 450 اور 650 nm طول موج پر پتہ لگا سکے تو بہتر ہے)۔

2. مائیکرو پلیٹ شیکر۔

3. RNase فری ٹپس اور سینٹری فیوج ٹیوب۔

آپریشن فلو چارٹ

اس سے پہلے کہ آپ شروع کریں۔

1. استعمال سے پہلے کٹ کے تمام اجزاء اور نمونے کمرے کے درجہ حرارت (18-25℃) پر لائیں۔اگر کٹ ایک ہی وقت میں استعمال نہیں ہو گی، تو براہ کرم موجودہ تجربے کے لیے صرف سٹرپس اور ریجنٹس نکالیں، اور باقی سٹرپس اور ری ایجنٹس کو مطلوبہ حالت میں چھوڑ دیں۔

2. واش بفر: 1× واش بفر کا 800mL تیار کرنے کے لیے 20× مرتکز واش بفر کے 40mL کو 760mL deionized یا distilled water کے ساتھ پتلا کریں۔

3. معیاری: استعمال سے پہلے اسٹاک سلوشن کو مختصر طور پر گھمائیں یا سینٹری فیوج کریں۔فراہم کردہ چار معیاروں کا ارتکاز 5ng/μL ہے۔UTP اور pUTP dsRNA معیارات کے لیے، براہ کرم سٹاک سلوشن کو 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL پر STE بفر کے ساتھ پتلا کر کے معیاری وکر کھینچیں۔N1-Me-pUTP dsRNA معیارات کے لیے، براہ کرم سٹاک سلوشن کو 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL پر STE بفر کے ساتھ پتلا کر کے معیاری کریو کھینچیں۔5-OMe-UTP dsRNA اسٹینڈرڈ کے لیے، براہ کرم سٹاک سلوشن کو 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL پر STE بفر کے ساتھ پتلا کر کے معیاری وکر کھینچیں۔ہم تجویز کرتے ہیں کہ درج ذیل چارٹ کے طور پر معیارات کو کمزور کیا جا سکتا ہے:

4. Biotinylated پتہ لگانے کے اینٹی باڈی اور HRP-streptavidin ورکنگ سلوشن: استعمال کرنے سے پہلے اسٹاک سلوشن کو مختصر طور پر گھمائیں یا سینٹری فیوج کریں۔انہیں کم کرنے والے بفر کے ساتھ کام کرنے والے ارتکاز میں پتلا کریں۔

5. TMB سب سٹیٹ: جراثیم سے پاک ٹپس کے ساتھ محلول کی مطلوبہ خوراک کو اسپائریٹ کریں اور باقی ماندہ محلول کو دوبارہ شیشی میں نہ ڈالیں۔TMB سبسٹریٹ روشنی کے لیے حساس ہے، TMB سبسٹریٹ کو زیادہ دیر تک روشنی میں نہ رکھیں۔

پروٹوکول کا استعمال

1. پرکھ کے لیے درکار سٹرپس کی تعداد کا تعین کریں۔استعمال کے لیے فریموں میں سٹرپس ڈالیں۔اس پرکھ میں استعمال نہ ہونے والی باقی پلیٹ سٹرپس کو بیگ میں دوبارہ ڈیسیکنٹ کے ساتھ پیک کرنا چاہیے۔ریفریجریٹڈ اسٹوریج کے لیے بیگ کو مضبوطی سے بند کریں۔

2. مناسب کنوؤں میں معیاری، خالی اور نمونوں میں سے ہر ایک کو 100μL شامل کریں۔پلیٹ سیلر سے ڈھانپیں۔500rpm پر ہلتے ہوئے کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے تک انکیوبیٹ کریں۔نمونوں کو درست پرکھ کے لیے مناسب ارتکاز کے لیے STE بفر کے ساتھ پتلا کیا جانا چاہیے۔

3. دھونے کا مرحلہ: محلول کو اسپائریٹ کریں اور ہر کنویں کو 250μL واش بفر سے دھوئیں اور اسے 30 سیکنڈ تک کھڑا رہنے دیں۔پلیٹ کو جاذب کاغذ پر چھین کر واش بفر کو مکمل طور پر ضائع کر دیں۔مکمل طور پر 4 بار دھونا۔

4. ہر کنویں میں 100μL بایوٹینیلیٹڈ ڈیٹیکشن اینٹی باڈی ورکنگ سلوشن شامل کریں۔پلیٹ سیلر سے ڈھانپیں۔500rpm پر ہلتے ہوئے کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹے تک انکیوبیٹ کریں۔

5. دھونے کا مرحلہ دہرائیں۔

6. ہر کنویں میں 100μL HRP-streptavidin ورکنگ سلوشن شامل کریں۔پلیٹ سیلر سے ڈھانپیں۔500rpm پر ہلاتے ہوئے کمرے کے درجہ حرارت پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔

7. دوبارہ دھونے کا مرحلہ دہرائیں۔

8. ہر کنویں میں 100μL TMB سبسٹریٹ محلول شامل کریں۔پلیٹ سیلر سے ڈھانپیں۔RT پروٹیکٹ پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔سبسٹریٹ محلول کے اضافے سے مائع نیلا ہو جائے گا۔

9. ہر کنویں میں 50μL سٹاپ محلول شامل کریں۔سٹاپ سلوشن کے اضافے سے مائع پیلا ہو جائے گا۔پھر مائیکرو پلیٹ ریڈر چلائیں اور فوری طور پر 450nm پر پیمائش کریں۔

نتائج کا حساب کتاب

1. ہر معیار، کنٹرول، اور نمونوں کے لیے ڈپلیکیٹ ریڈنگ کا اوسط لیں اور اوسط صفر معیاری نظری کثافت کو گھٹائیں۔عمودی (Y) محور پر جاذبیت اور افقی (X) محور پر dsRNA ارتکاز کے ساتھ ایک معیاری وکر بنائیں۔

2. کمپیوٹر پر مبنی کریو فٹنگ سافٹ ویئر جیسے کریو ماہر 1.3 یا ELISA Calc 5 یا 4 پیرامیٹر کے نان لکیری فٹ ماڈل میں حساب کتاب کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔

کارکردگی

1. حساسیت:

پتہ لگانے کی کم حد: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA کے لیے)، ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA کے لیے)۔

مقدار کی کم حد: 0.0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA کے لیے)، 0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA کے لیے)، 0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA کے لیے)۔

2. درستگی: انٹرا اسے کا CV ≤10%، انٹر-Asay کا CV ≤10%

3. بازیابی: 80%~120%

4. خطاطی:0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA)، 0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA کے لیے)۔

تحفظات

1. TMB رد عمل کا درجہ حرارت اور وقت اہم ہے، براہ کرم انہیں ہدایات کے مطابق سختی سے کنٹرول کریں۔

2. اچھی پرکھ کی تولیدی صلاحیت اور حساسیت کو حاصل کرنے کے لیے، اضافی غیر رد عمل والے ری ایجنٹس کو ہٹانے کے لیے پلیٹوں کو مناسب طریقے سے دھونا ضروری ہے۔

3. استعمال کرنے سے پہلے تمام ری ایجنٹس کو اچھی طرح سے ملایا جانا چاہیے اور نمونے یا ری ایجنٹس کے اضافے کے دوران بومبل سے بچنا چاہیے۔

4. اگر کرسٹل سنسریٹڈ واش بفر (20x) میں بن گئے ہیں، تو 37℃ تک گرم کریں اور آہستہ سے مکس کریں جب تک کہ کرسٹل مکمل طور پر تحلیل نہ ہو جائیں۔

5. سوڈیم ایزائیڈ (NaN3) پر مشتمل نمونوں کی جانچ سے پرہیز کریں، کیونکہ یہ HRP سرگرمی کو تباہ کر سکتا ہے جس کے نتیجے میں dsRNA کی مقدار کا تخمینہ کم ہو جاتا ہے۔

6. پرکھ کے دوران RNase آلودگی سے بچیں۔

7. معیاری/نمونہ، پتہ لگانے والے اینٹی باڈی اور SA-HRP کو ​​بغیر ہلائے RT پر بھی کیا جا سکتا ہے، لیکن اس سے پتہ لگانے کی حساسیت میں ایک گنا کمی واقع ہو سکتی ہے۔اس معاملے کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ UTP اور pUTP dsRNA معیارات کو 2pg/μL سے کم کیا جائے، N1-Me-pUTP dsRNA معیارات کو 4pg/μL سے کم کیا جائے اور 5-OMe-UTP dsRNA معیار کو 8pg/μL سے کم کیا جائے۔اس کے علاوہ، HRP-streptavidin ورکنگ سلوشن کو کمرے کے درجہ حرارت پر 60 منٹ تک لگائیں۔فلاسک شیکر کا استعمال نہ کریں، کیونکہ فلاسک شیکر کا نتیجہ غلط نکل سکتا ہے۔

عام نتیجہ

1. معیاری وکر ڈیٹا

2. معیاری وکر کا حساب کتاب

3. لائنر کا پتہ لگانے کی حد: 0.0312- 1pg/μL