PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F) گلائکوپروٹینز سے تقریباً تمام N سے منسلک oligosaccharides کو ہٹانے کا سب سے مؤثر انزیمیٹک طریقہ ہے۔PNGase F ایک امیڈیس ہے، جو N-linked glycoproteins سے ہائی میننوز، ہائبرڈ، اور پیچیدہ oligosaccharides کے اندرونی سب سے زیادہ GlcNAc اور asparagine کی باقیات کے درمیان ٹوٹ جاتا ہے۔
درخواست
یہ انزائم پروٹین سے کاربوہائیڈریٹ کی باقیات کو ہٹانے کے لیے مفید ہے۔
تیاری اور تفصیلات
| ظہور | بے رنگ مائع |
| پروٹین کی پاکیزگی | ≥95% (SDS-PAGE سے) |
| سرگرمی | ≥500,000 U/mL |
| Exoglycosidase | کسی سرگرمی کا پتہ نہیں چل سکا (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| پروٹیز | ND |
پراپرٹیز
| ای سی نمبر | 3.5.1.52(مائیکروجنزم سے دوبارہ پیدا ہونے والا) |
| سالماتی وزن | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| آئیسو الیکٹرک پوائنٹ | 8. 14 |
| بہترین پی ایچ | 7.0-8.0 |
| زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت | 65 °C |
| سبسٹریٹ کی خصوصیت | GlcNAc اور asparagine کی باقیات کے درمیان گلائکوسیڈک بانڈز کو صاف کرنا تصویر 1۔ |
| شناختی سائٹس | این سے منسلک گلائکینز جب تک کہ α1-3 فیکوز پر مشتمل نہ ہو تصویر 2 |
| ایکٹیوٹرز | ڈی ٹی ٹی |
| روکنے والا | ایس ڈی ایس |
| ذخیرہ اندوزی کا درجہ حرارت | -25 ~-15 ℃ |
| حرارت کو غیر فعال کرنا | 1µL PNGase F پر مشتمل 20µL رد عمل کا مرکب 75 °C پر 10 منٹ کے لیے انکیوبیشن کے ذریعے غیر فعال ہوجاتا ہے۔ |
تصویر 1 PNGase F کی سبسٹریٹ کی خصوصیت
تصویر 2 PNGase F کی پہچان۔
جب اندرونی GlcNAc باقیات α1-3 فیوکوز سے منسلک ہوتے ہیں، تو PNGase F N-linked oligosaccharides کو glycoproteins سے نہیں نکال سکتا۔یہ تبدیلی پودوں اور کچھ کیڑے گلائکوپروٹینز میں عام ہے۔
Cاجزاء
|
| اجزاء | توجہ مرکوز کرنا |
| 1 | PNGase F | 50 μl |
| 2 | 10×گلائکوپروٹین ڈینیچرنگ بفر | 1000 μl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 μl |
یونٹ کی تعریف
ایک یونٹ(U) کو 10 µL کے کل رد عمل والیوم میں 37°C پر 1 گھنٹے میں 10 µg منحرف RNase B سے کاربوہائیڈریٹ کے 95% کو خارج کرنے کے لیے درکار انزائم کی مقدار کے طور پر بیان کیا جاتا ہے۔
رد عمل کے حالات
1. 1-20 µg گلائکوپروٹین کو ڈیونائزڈ پانی کے ساتھ تحلیل کریں، 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer اور H2O (اگر ضروری ہو) شامل کریں تاکہ 10 µl کل رد عمل کا حجم بنایا جاسکے۔
2.100 ° C پر 10 منٹ تک انکیوبیٹ کریں، اسے برف پر ٹھنڈا کریں۔
3.2 µl 10×GlycoBuffer 2، 2 µl 10% NP-40 شامل کریں اور مکس کریں۔
4.1-2 µl PNGase F اور H شامل کریں۔2O (اگر ضروری ہو) 20 µl کل رد عمل والیوم اور مکس کرنے کے لیے۔
5.60 منٹ کے لئے 37 ° C پر ردعمل کو انکیوبیٹ کریں۔
6.SDS-PAGE تجزیہ یا HPLC تجزیہ کے لیے۔
