ویکسینیا وائرس کیپنگ انزائم
ویکسینیا وائرس کیپنگ انزائم ایک ریکومبیننٹ ای کولی اسٹرین سے اخذ کیا گیا ہے جو ویکسینیا کیپنگ انزائم کے لیے جین لے جاتا ہے۔یہ واحد انزائم دو ذیلی یونٹس (D1 اور D12) پر مشتمل ہے اور اس میں تین انزیمیٹک سرگرمیاں ہیں (RNA triphosphatase اور guanylyltransferase by D1 subunit اور guanine methyltransferase by D12 subunit)۔ویکسینیا وائرس کیپنگ اینزائم ٹوپی ڈھانچے کی تشکیل کو متحرک کرنے کے لیے موثر ہے، جو خاص طور پر 7-میتھائل گوانائلیٹ کیپ ڈھانچہ (m7Gppp، Cap 0) کو RNA کے 5′ سرے سے جوڑ سکتا ہے۔کیپ کا ڈھانچہ (کیپ 0) ایم آر این اے کے استحکام، نقل و حمل اور یوکرائٹس میں ترجمہ میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔انزیمیٹک ری ایکشن کے ذریعے آر این اے کی کیپنگ ایک موثر اور آسان طریقہ ہے جو وٹرو ٹرانسکرپشن، ٹرانسفیکشن اور مائیکرو انجیکشن کے لیے RNA کے استحکام اور ترجمہ کو نمایاں طور پر بہتر بنا سکتا ہے۔
اجزاء
ویکسینیا وائرس کیپنگ انزائم (10 U/μL)
10×کیپنگ بفر
ذخیرہ کرنے کے حالات
سٹوریج کے لیے -25～- 15℃ （بار بار جمنے سے گریز کریں
اسٹوریج بفر
20 mM Tris-HCl (pH 8.0)، 100 mM NaCl،
1mM DTT، 0. 1mM EDTA، 0. 1% Triton X- 100، 50% گلیسرول۔
یونٹ کی تعریف
ویکسینیا وائرس کیپنگ اینزائم کی ایک اکائی کو 37°C پر 1 گھنٹے میں GTP کے 10pmol کو 80nt ٹرانسکرپٹ میں شامل کرنے کے لیے درکار انزائم کی مقدار کے طور پر بیان کیا گیا ہے۔
کوالٹی کنٹرول
Exonuclease:ویکسینیا وائرس کیپنگ اینزائم کا 10U 1μg λ-Hind III ڈائجسٹ ڈی این اے کے ساتھ 37 ℃ پر 16 گھنٹے تک کوئی انحطاط پیدا نہیں کرتا جیسا کہ ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعہ طے کیا گیا ہے۔
اینڈونکلیز:ویکسینیا وائرس کیپنگ اینزائم کا 10U 1μg λDNA کے ساتھ 37℃ پر 16 گھنٹے تک کوئی انحطاط نہیں پیدا کرتا ہے جیسا کہ ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے طے کیا گیا ہے۔
نکاس:ویکسینیا وائرس کیپنگ اینزائم کا 10U 1 μg pBR322 کے ساتھ 37 ℃ پر 16 گھنٹے تک کوئی انحطاط نہیں پیدا کرتا ہے جیسا کہ ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعہ طے کیا گیا ہے۔
RNase:ویکسینیا وائرس کیپنگ اینزائم کا 10U 1.6μg MS2 RNA کے ساتھ 37℃ پر 4 گھنٹے تک کوئی انحطاط پیدا نہیں کرتا جیسا کہ ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے طے کیا گیا ہے۔
1.کولی ڈی این اے:ویکسینیا وائرس کیپنگ اینزائم کا 10U E. coli genomic DNA کی موجودگی کے لیے TaqMan qPCR کا استعمال کرتے ہوئے E. coli 16S rRNA لوکس کے لیے مخصوص پرائمر کے ساتھ اسکرین کیا جاتا ہے۔E. کولی جینومک DNA آلودگی ≤1 E. کولی جینوم ہے۔
2.بیکٹیریل اینڈوٹوکسین: LAL-ٹیسٹ، چینی فارماکوپیا IV 2020 ایڈیشن کے مطابق، جیل کی حد ٹیسٹ کا طریقہ، عام اصول (1143)۔بیکٹیریل اینڈوٹوکسن کا مواد ≤10 EU/mg ہونا چاہیے۔
رد عمل کا نظام اور حالات
1. کیپنگ پروٹوکول (رد عمل کا حجم: 20 μL)
یہ طریقہ کار 10μg RNA (≥100 nt) کے کیپنگ ری ایکشن پر لاگو ہوتا ہے اور اسے تجرباتی مطالبات کے مطابق بڑھایا جا سکتا ہے۔
I) 1.5 ملی لیٹر مائیکرو فیوج ٹیوب میں 10μg RNA اور نیوکلیز فری H2O کو 15.0 μL کے حتمی حجم میں ملا دیں۔*10×کیپنگ بفر: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)
2) 5 منٹ کے لیے 65 ℃ پر گرم کریں اور اس کے بعد 5 منٹ کے لیے برف سے غسل کریں۔
3) درج ذیل اجزاء کو مخصوص ترتیب میں شامل کریں۔
| Cحامی | Volume |
| منحرف RNA (≤10μg, length≥100 nt) | 15 μL |
| 10×کیپنگ بفر* | 2 μL |
| GTP (10 ایم ایم) | 1 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| ویکسینیا وائرس کیپنگ انزائم (10U/μL) | 1 μL |
*10×کیپنگ بفر: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)
4) 37 ° C پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں، RNA اب بند ہو گیا ہے اور نیچے کی طرف ایپلی کیشنز کے لیے تیار ہے۔
2. 5′ ٹرمینل لیبلنگ ردعمل (رد عمل کا حجم: 20 μL)
یہ پروٹوکول 5´ ٹرائی فاسفیٹ پر مشتمل RNA کو لیبل کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے اور اسے مطالبات کے مطابق بڑھایا جا سکتا ہے۔لیبل شامل کرنے کی کارکردگی آر این اے کے داڑھ تناسب سے متاثر ہوگی: جی ٹی پی، نیز آر این اے نمونوں میں جی ٹی پی مواد۔
1) 1.5 ملی لیٹر مائیکرو فیوج ٹیوب میں RNA اور نیوکلیز فری H2O کی مناسب مقدار کو 14.0 µL کے حتمی حجم میں ملا دیں۔
2) 5 منٹ کے لیے 65 ℃ پر گرم کریں اور اس کے بعد 5 منٹ کے لیے برف سے غسل کریں۔
3) درج ذیل اجزاء کو مخصوص ترتیب میں شامل کریں۔
| Cحامی | Volume |
| منحرف آر این اے | 14 μL |
| 10×کیپنگ بفر | 2 μL |
| جی ٹی پی مکس** | 2 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| ویکسینیا وائرس کیپنگ انزائم (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX سے مراد GTP اور مارکر کی ایک چھوٹی سی تعداد ہے۔GTP کے ارتکاز کے لیے، رجوع کریں۔نوٹ 3.
4) 37 ° C پر 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں، RNA 5′ سرے پر اب لیبل لگا ہوا ہے اور نیچے کی طرف جانے کے لیے تیار ہے۔
درخواستیں
1. ترجمے کے اسیس/ان وٹرو ترجمہ سے پہلے mRNA کیپنگ
2. mRNA کے 5' سرے پر لیبل لگانا
استعمال پر نوٹس
1.ویکسینیا کیپنگ اینزائم کے ساتھ انکیوبیشن سے پہلے آر این اے کے محلول کو گرم کرنے سے ٹرانسکرپٹ کے 5' آخر میں ثانوی ڈھانچہ ہٹ جاتا ہے۔معروف انتہائی ساختی 5'اینڈز کے ساتھ ٹرانسکرپٹس کے لیے وقت 60 منٹ تک بڑھائیں۔
2. کیپنگ ری ایکشن کے لیے استعمال ہونے والے RNA کو استعمال سے پہلے صاف کیا جانا چاہیے اور نیوکلیز فری پانی میں معطل کر دیا جانا چاہیے۔EDTA موجود نہیں ہونا چاہیے اور محلول نمکیات سے پاک ہونا چاہیے۔
3. 5´ سرے پر لیبل لگانے کے لیے، کل GTP ارتکاز رد عمل میں mRNA کے داڑھ کے ارتکاز سے تقریباً 1-3 گنا ہونا چاہیے۔
4. ری ایکشن سسٹم کا حجم اصل کے مطابق اوپر یا نیچے کیا جا سکتا ہے۔
