اینڈو فری پلازمیڈ میکسی کٹ
یہ کٹ 150 - 300 ملی لیٹر بیکٹیریل محلول سے نکالنے کے لیے موزوں ہے جو بیکٹیریا کو ختم کرنے کے لیے ایک بہتر SDS-alkaline lysis طریقہ استعمال کرتے ہوئے، راتوں رات کلچر کیا جاتا ہے۔خام عرق کو منتخب طور پر ایک منفرد Endotoxin Scavenger کے ساتھ ملایا جاتا ہے اور endotoxins کو ہٹانے کے لیے سینٹرفیوگریشن کے ذریعے الگ کیا جاتا ہے۔اس کے بعد، سلیکا جیل جھلی انتخابی طور پر زیادہ نمک اور کم پی ایچ کے حالات میں محلول میں پلاسمڈ ڈی این اے سے منسلک ہوتی ہے۔اس کے بعد نجاست اور دیگر بیکٹیریل اجزاء کو دور کرنے کے لیے واش بفر کا اضافہ کیا جاتا ہے۔آخر میں، ایک کم نمک، اعلی پی ایچ ایلیوشن بفر کا استعمال سلیکون میٹرکس جھلی سے خالص پلاسمڈ ڈی این اے کو خارج کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔سیلیکا جیل جھلی خصوصی جذب جھلی کا استعمال کرتی ہے، اور کالم اور کالم کے درمیان جذب کی مقدار کا فرق بہت کم ہے اور تکرار کی صلاحیت اچھی ہے۔فینول، کلوروفارم اور دیگر زہریلے ری ایجنٹس کی ضرورت نہیں ہے، اور نہ ہی ایتھنول کی بارش کے اقدامات ہیں۔اس کٹ کو تیزی سے 0.2 -1.5 ملی گرام خالص ہائی کاپی پلاسمڈ DNA نکالنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، جس کی نکالنے کی شرح 80% -90% ہے۔کٹ میں اینڈوٹوکسین کو ہٹانے کا ایک انوکھا پروسیس فارمولا استعمال کیا گیا ہے، اینڈوٹوکسین کا مواد انتہائی کم ہے اور سیل ٹرانسفیکشن کا اثر بہترین ہے۔نکالا گیا پلازمیڈ براہ راست انزائم ہاضمہ، پی سی آر، وٹرو ٹرانسکرپشن، ٹرانسفارمیشن، سیکوینسنگ اور دیگر سالماتی حیاتیات کے تجربات میں استعمال کیا جا سکتا ہے۔
ذخیرہ کرنے کے حالات
RNaseA کو -30 ~ -15℃ پر ذخیرہ کیا جانا چاہیے اور ≤0℃ پر منتقل کیا جانا چاہیے۔
Endotoxin Scavenger کو ایک ماہ کے لیے 2 ~ 8 ℃ پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے، طویل مدتی سٹوریج کے لیے -30 ~ -15 ℃ پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔اور ≤0℃ پر منتقل کیا جاتا ہے۔
دیگر اجزاء کو کمرے کے درجہ حرارت (15 ~ 25 ℃) پر ذخیرہ کیا جانا چاہئے اور کمرے کے درجہ حرارت پر منتقل کیا جانا چاہئے۔
اجزاء
| اجزاء | 10RXNS |
| آر نیس اے | 750 μL |
| بفر P1 | 75 ملی لیٹر |
| بفر P2 | 75 ملی لیٹر |
| بفر P4 | 75 ملی لیٹر |
| اینڈوٹوکسین سکیوینجر | 25 ملی لیٹر |
| بفر پی ڈبلیو | 2 × 22 ملی لیٹر |
| بفر ٹی بی | 20 ملی لیٹر |
| فاسٹ پیور ڈی این اے میکسی کالم (ہر ایک 50 ملی لیٹر کلیکشن ٹیوب میں) | 10 |
| اینڈوٹوکسین فری کلیکشن ٹیوب | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml، RNA کو ہٹانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
بفر P1:بیکٹیریل سسپنشن بفر، پہلے استعمال سے پہلے RNaseA کو بفر P1 میں شامل کریں۔
بفر P2:بیکٹیریل لیسز بفر (جس میں SDS/NaOH ہوتا ہے)۔
بفر P4:غیر جانبدار بفر.
Endotoxin Scavenger:مؤثر طریقے سے خام پلازمیڈ نچوڑ سے endotoxin کو ہٹا دیں.
بفر PW:بفر کو دھو لیں، پہلے استعمال سے پہلے ایتھنول کا مقررہ حجم شامل کریں۔
بفر ٹی بی:elution بفر.
فاسٹ پیور ڈی این اے میکسی کالم:پلازمڈ ڈی این اے جذب کالم.
مجموعہ ٹیوبیں 50 ملی لیٹر:فلٹریٹ جمع کرنے والی ٹیوبیں۔
اینڈوٹوکسین سے پاک کلیکشن ٹیوب:پلازمڈ ڈی این اے جمع کرنے والی ٹیوبیں۔
تیار شدہ مواد
مطلق ایتھنول، آئسوپروپانول، 50 ملی لیٹر گول نیچے سینٹری فیوج ٹیوبیں اور 50 ملی لیٹر اینڈوٹوکسین سے پاکسینٹری فیوج ٹیوبیں
درخواستیں
یہ پروڈکٹ 150 - 300 ملی لیٹر بیکٹیریل محلول سے بڑے پیمانے پر پلازمیڈ نکالنے کے لیے موزوں ہےراتوں رات مہذب.
تجرباتی عمل
1. 150 - 200 ملی لیٹر (300 ملی لیٹر سے زیادہ نہیں) بیکٹیریل محلول کو راتوں رات کلچر کریں اور سنٹری فیوج کریں۔1 - 2 منٹ کے لیے تقریباً 11,000 rpm (12,000 × g)۔سپرنٹنٹ کو ضائع کریں اور بیکٹیریا جمع کریں۔
Δ 50 ملی لیٹر سے زیادہ بیکٹیریل محلول جمع کرتے وقت، بیکٹیریا کو بیکٹیریل محلول، سینٹرفیوگریشن، سپرناٹینٹ کو خارج کر کے اور اسی 50 ملی لیٹر ٹیوب میں دیگر مراحل شامل کر کے جمع کیا جا سکتا ہے۔
بارہا.
2. سینٹری فیوج میں 7.5 ملی لیٹر بفر P1 شامل کریں (براہ کرم چیک کریں کہ آیا بفر P1 میں RNaseA شامل کیا گیا ہے)بیکٹیریا پر مشتمل ٹیوب اور بھنور یا پائپٹنگ کے ذریعہ اچھی طرح مکس کریں۔
Δ اس مرحلے میں بیکٹیریا کی مکمل دوبارہ معطلی پیداوار کے لیے اہم ہے، اور دوبارہ معطلی کے بعد کوئی بیکٹیریا کا جھنڈ نہیں ہونا چاہیے۔اگر بیکٹیریل کلپس ہیں جو اچھی طرح سے مکس نہیں ہوتے ہیں، تو یہ لیسس کو متاثر کرے گا، جس کے نتیجے میں کم پیداوار اور پاکیزگی ہوگی.اگر بیکٹیریل محلول کا OD600 0.65 ہے، تو یہ سفارش کی جاتی ہے کہ 150 ملی لیٹر بیکٹیریل محلول سے نکالتے وقت 7.5 ملی لیٹر بفر P1 استعمال کیا جائے۔جب OD600 0.75 ہو تو بفر P1 کا 8 ملی لیٹر استعمال کیا جانا چاہیے اور بفرز P2 اور P4 کے حجم کو اسی کے مطابق تبدیل کرنا چاہیے۔اگر بیکٹیریل محلول کا حجم 200 ملی لیٹر تک بڑھایا جاتا ہے، تو یہ سفارش کی جاتی ہے کہبفرز P1، P2، اور P4 کا حجم متناسب طور پر بڑھایا جائے۔
3. مرحلہ 2 سے بیکٹیریل سسپنشن میں بفر P2 کا 7.5 ملی لیٹر شامل کریں اور 6-8 تک آہستہ سے اوپر اور نیچے مکس کریں۔اوقات اور کمرے کے درجہ حرارت پر 4 - 5 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔
Δ اچھی طرح مکس کرنے کے لیے آہستہ سے الٹ دیں۔ورٹیکسنگ جینومک ڈی این اے کے ٹکڑے ہونے کا سبب بنے گی، جس کے نتیجے میں نکالے گئے پلازمیڈ میں جینومک ڈی این اے کے ٹکڑے ہوتے ہیں۔اس وقت، محلول چپچپا اور پارباسی ہو جاتا ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ بیکٹیریا مکمل طور پر ختم ہو چکے ہیں۔پلاسمیڈ کی تباہی سے بچنے کے لیے دورانیہ 5 منٹ سے زیادہ نہیں ہونا چاہیے۔اگر حل واضح نہیں ہے، تو اس کے نتیجے میں بہت زیادہ بیکٹیریا ہوسکتے ہیںنامکمل lysis، لہذا بیکٹیریا کی مقدار کو مناسب طریقے سے کم کیا جانا چاہئے.
4. مرحلہ 3 سے بیکٹیریل سسپنشن میں 7.5 ملی لیٹر بفر P4 شامل کریں اور فوری طور پر 6 سے 8 بار ہلکے سے الٹ دیں تاکہ محلول بفر P2 کو مکمل طور پر بے اثر کر سکے۔اس وقت، سفید flocculent precipitate ظاہر ہونا چاہئے.10 - 15 منٹ کے لیے تقریباً 11,000 rpm (12,000 × g) سے زیادہ پر سینٹری فیوج کریں، سپرنٹنٹ کو احتیاط سے ایک نئی 50 ملی لیٹر گول نیچے سنٹری فیوج ٹیوب (خود تیار) میں پپیٹ کریں اور اس سے بچیں۔تیرتے ہوئے سفید پرسیپیٹیٹ کی خواہش کریں۔
بفر P4 شامل کریں اور اچھی طرح مکس کرنے کے لیے فوراً الٹ دیں۔ٹیوب کو اس وقت تک کھڑا رہنے دیں جب تک کہ سفید ورن کو پورے محلول میں یکساں طور پر تقسیم نہ کر دیا جائے تاکہ مقامی ورن کی پیداوار کو روکا جا سکے جو کہ نیوٹرلائزیشن کو متاثر کر سکتا ہے۔اگر سینٹرفیوگریشن سے پہلے یکساں سفید فلوکولینٹ پریپیٹیٹ نہ ہو اور سنٹری فیوگریشن کے بعد سپرنٹنٹ واضح نہ ہو تو ٹیوب ہو سکتی ہے۔ایک اور 5 منٹ کے لئے سینٹرفیوجڈ.
5. مرحلہ 4 سے سپرناٹینٹ میں Endotoxin Scavenger کے حجم کا 0. 1 گنا (سپرناٹینٹ والیوم کا 10%، تقریباً 2.2 ملی لیٹر) شامل کریں اور مکس کرنے کے لیے الٹ دیں۔محلول کو برف کے غسل میں رکھیں یا پسے ہوئے برف (یا فریج فریزر) میں 5 منٹ کے لیے ڈالیں جب تک کہ محلول ٹربڈ سے صاف اور شفاف ہو جائے (یا پھر بھیتھوڑا سا گندا) اور کبھی کبھار کئی بار ملا دیں۔
Δ اینڈوٹوکسین سکیوینجر کو سپرناٹینٹ میں شامل کرنے کے بعد، سپرنٹنٹ گندا ہو جائے گا لیکنبرف کے غسل میں ٹھنڈا ہونے کے بعد سپرنٹنٹ صاف (یا تھوڑا سا ٹربڈ) ہو جانا چاہیے۔
6. جب سپرنیٹنٹ کو کمرے کے درجہ حرارت (>25℃) پر 10 - 15 منٹ تک رکھا جائے گا، تو یہ ٹربڈ ہو جائے گااس کا درجہ حرارت کمرے کے درجہ حرارت تک بڑھ جاتا ہے۔اس کے بعد سپرنٹیننٹ کو مکس کرنے کے لیے الٹا ہونا چاہیے۔
Δ اگر کمرے کا درجہ حرارت کم ہے یا آپ نکالنے کے وقت کو کم کرنا چاہتے ہیں تو، سپرنٹنٹ کو 37 ~ 42 ℃ پانی کے غسل میں 5 - 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا جا سکتا ہے اور اگلا مرحلہ سپرنٹنٹ کے بعد کیا جا سکتا ہے۔گندا ہو جاتا ہے.
7. فیز کو الگ کرنے کے لیے کمرے کے درجہ حرارت پر 10 منٹ کے لیے تقریباً 11,000 rpm (12,000 × g) پر سپرناٹینٹ کو سینٹری فیوج کریں (درجہ حرارت >25℃ ہونا چاہیے)۔پانی کے اوپری حصے میں ڈی این اے ہوتا ہے جبکہ نچلے نیلے رنگ کے تیل والے مرحلے میں اینڈوٹوکسین اور دیگر نجاستیں ہوتی ہیں۔کو منتقل کریں۔ڈی این اے پر مشتمل ایک نئی ٹیوب میں پانی کا مرحلہ اورتیل کی پرت کو ضائع کریں.
Δ سینٹرفیوگریشن کے دوران درجہ حرارت 25 ℃ سے زیادہ ہونا چاہیے کیونکہ مؤثر مرحلے کی علیحدگی نہیں ہوتیاگر درجہ حرارت بہت کم ہو تو ہوتا ہے۔
Δ اگر مرحلے کی علیحدگی مؤثر نہیں ہے تو، سینٹرفیوگریشن درجہ حرارت کو 30 ℃ اور ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہےسینٹرفیوگریشن کا وقت 15 منٹ تک بڑھایا جا سکتا ہے۔
Δ نیلی تیل کی تہہ کو نہ چوسیں کیونکہ اس میں اینڈوٹوکسین اور دیگر نجاستیں ہوتی ہیں۔
میکانزم
Resuspension Lysis نیوٹرلائزیشن
◇ 7.5 ملی لیٹر بفر P1 شامل کریں۔
◇ 7.5 ملی لیٹر بفر P2 شامل کریں۔
◇ 7.5 ملی لیٹر بفر P4 شامل کریں۔
اینڈوٹوکسن کو ہٹانا
◇ Endotoxin Scavenger کے سپرنٹنٹ والیوم سے 0. 1 گنا اضافہ کریں۔
بائنڈنگ اور واشنگ
◇ isopropanol کے حجم سے 0.5 گنا اضافہ کریں۔
◇ 10 ملی لیٹر بفر پی ڈبلیو شامل کریں۔
◇ 10 ملی لیٹر بفر پی ڈبلیو شامل کریں۔
Elution
◇ 1 - 2 ملی لیٹر بفر ٹی بی یا اینڈوٹوکسین فری ddH2O شامل کریں
