M-MLV Neoscript ریورس ٹرانسکرپٹیز
Neoscript ریورس ٹرانسکرپٹیس ایک ریورس ٹرانسکرپٹیس ہے جو E.coli میں Moloney murine لیوکیمیا وائرس کی اصل اور اظہار کے M-MLV جین کی تبدیلی کی اسکریننگ کے ذریعے حاصل کی گئی ہے۔انزائم RNase H سرگرمی کو ہٹاتا ہے، زیادہ درجہ حرارت برداشت کرتا ہے، اور یہ اعلی درجہ حرارت ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے موزوں ہے۔لہٰذا، یہ آر این اے کے اعلیٰ سطحی ڈھانچے اور سی ڈی این اے کی ترکیب پر غیر مخصوص عوامل کے منفی اثرات کو ختم کرنے میں مددگار ہے، اور اس میں اعلیٰ استحکام اور ریورس ٹرانسکرپشن ترکیب کی صلاحیت ہے۔انزائم میں زیادہ استحکام اور ریورس ٹرانسکرپشن سنتھیسز کی صلاحیت ہے۔
اجزاء
1.200 U/μL Neoscript ریورس ٹرانسکرپٹیز
2.5 × فرسٹ اسٹرینڈ بفر (اختیاری)
* 5 × فرسٹ اسٹرینڈ بفر میں dNTP شامل نہیں ہے، براہ کرم رد عمل کا نظام تیار کرتے وقت dNTPs شامل کریں
تجویز کردہ درخواست
1.ایک قدمی qRT-PCR۔
2.آر این اے وائرس کا پتہ لگانا۔
اسٹوریج کی حالت
طویل مدتی اسٹوریج کے لیے -20 ° C، استعمال سے پہلے اچھی طرح مکس ہونا چاہیے، بار بار جمنے سے گریز کریں۔
یونٹ کی تعریف
ایک یونٹ پولی(A)•oligo(dT) کا استعمال کرتے ہوئے 37°C پر 10 منٹ میں 1 nmol dTTP کو شامل کرتا ہے۔25ٹیمپلیٹ/پرائمر کے طور پر۔
کوالٹی کنٹرول
1.SDS-PAGE الیکٹروفوریٹک طہارت 98% سے زیادہ ہے۔
2.ایمپلیفیکیشن حساسیت، بیچ ٹو بیچ کنٹرول، استحکام۔
3.کوئی خارجی نیوکلیز سرگرمی نہیں، کوئی خارجی اینڈونکلیز یا ایکزونوکلیز آلودگی نہیں
پہلے سلسلہ کے رد عمل کے حل کے لیے ری ایکشن سیٹ اپ
1.رد عمل کے مرکب کی تیاری
| اجزاء | حجم |
| Oligo (dT)12-18 پرائمر یا رینڈم پرائمرa یا جین کے مخصوص پرائمرb | شام 50 بجے |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| دوپہر 2 بجے | |
| 10 ایم ایم ڈی این ٹی پی | 1 μL |
| ٹیمپلیٹ آر این اے | کل RNA≤ 5μg؛mRNA≤ 1 μg |
| آر نیس فری ڈی ایچ2O | 10 μL تک |
نوٹس:a/b: براہ کرم اپنی تجرباتی ضروریات کے مطابق مختلف قسم کے پرائمر منتخب کریں۔
2.5 منٹ کے لیے 65 ° C پر گرم کریں اور 2 منٹ کے لیے برف پر تیزی سے ٹھنڈا کریں۔
3.مندرجہ بالا سسٹم میں درج ذیل اجزاء کو 20µL کے کل حجم میں شامل کریں اور آہستہ سے مکس کریں:
| اجزاء | حجم (μL) |
| 5 × فرسٹ اسٹرینڈ بفر | 4 |
| Neoscript ریورس ٹرانسکرپٹیس (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
| آر نیس فری ڈی ایچ2O | 20 μL تک |
4. براہ کرم مندرجہ ذیل شرائط کے مطابق ردعمل انجام دیں:
(1) اگر رینڈم پرائمر استعمال کیا جاتا ہے تو، رد عمل 10 منٹ کے لیے 25 ℃، اور پھر 30 ~ 60 منٹ کے لیے 50 ℃ پر کیا جانا چاہیے۔
(2) اگر Oligo dT یا مخصوص پرائمر استعمال کیے جاتے ہیں، تو رد عمل 50℃ پر 30~60 منٹ تک کیا جانا چاہیے۔
5.Neoscript ریورس ٹرانسکرپٹیس کو غیر فعال کرنے اور رد عمل کو ختم کرنے کے لیے 5 منٹ کے لیے 95℃ پر گرم کریں۔
6.ریورس ٹرانسکرپشن پروڈکٹس کو براہ راست PCR ری ایکشن اور فلوروسینس مقداری PCR ری ایکشن میں استعمال کیا جا سکتا ہے، یا لمبے عرصے تک -20℃ پر محفوظ کیا جا سکتا ہے۔
پی سی آر آرعمل:
1.رد عمل کے مرکب کی تیاری
| اجزاء | توجہ مرکوز کرنا |
| 10 × PCR بفر (dNTP مفت، Mg²+ مفت) | 1× |
| dNTPs (10mM ہر dNTP) | 200 μM |
| 25 ایم ایم ایم جی سی ایل2 | 1-4 ایم ایم |
| Taq DNA پولیمریز (5U/μL) | 2-2.5 U |
| پرائمر 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| پرائمر 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| سانچےa | ≤10% پہلا سلسلہ رد عمل حل (2 μL) |
| ڈی ڈی ایچ2O | 50 μL تک |
نوٹس:a: اگر بہت زیادہ پہلا سلسلہ رد عمل حل شامل کیا جائے تو PCR رد عمل کو روکا جا سکتا ہے۔
2.پی سی آر رد عمل کا طریقہ کار
| قدم | درجہ حرارت | وقت | سائیکل |
| پری ڈینیچریشن | 95℃ | 2-5 منٹ | 1 |
| ڈینیچریشن | 95℃ | 10-20 سیکنڈ | 30-40 |
| اینیلنگ | 50-60℃ | 10-30 سیکنڈ | |
| توسیع | 72℃ | 10-60 سیکنڈ |
نوٹس
1.42℃~55℃ کی حد میں ریورس ٹرانسکرپشن درجہ حرارت کی اصلاح کے لیے موزوں ہے۔
2.اس میں بہتر استحکام ہے، اعلی درجہ حرارت ریورس ٹرانسکرپشن ایمپلیفیکیشن کے لیے موزوں ہے۔اس کے علاوہ، یہ RNA کے پیچیدہ ساختی خطوں سے مؤثر طریقے سے گزرنے کے لیے سازگار ہے۔اس کے علاوہ، یہایک قدمی ملٹی پلیکس فلوروسینس مقداری RT-PCR کا پتہ لگانے کے لیے موزوں ہے۔
3.مختلف PCR ایمپلیفیکیشن انزائمز کے ساتھ اچھی مطابقت اور اعلی حساسیت RT-PCR رد عمل کے لیے موزوں ہے۔
4.اعلی سنویدنشیلتا ایک قدم فلوروسینس مقداری RT-PCR رد عمل کے لیے موزوں، ٹیمپلیٹس کے کم ارتکاز کی نشاندہی کی شرح کو مؤثر طریقے سے بہتر بناتا ہے۔
5.سی ڈی این اے لائبریری کی تعمیر کے لیے موزوں ہے۔
