Rnase inhibitor
Murine RNase inhibitor ایک recombinant murine RNase inhibitor ہے جس کا اظہار اور E.coli سے پاک کیا گیا ہے۔یہ RNase A, B یا C سے 1:1 کے تناسب سے نان کوولنٹ بانڈنگ کے ذریعے منسلک ہوتا ہے، اس طرح تینوں خامروں کی سرگرمی کو روکتا ہے اور RNA کو تنزلی سے بچاتا ہے۔تاہم، یہ Aspergillus سے RNase 1، RNase T1، S1 Nuclease، RNase H یا RNase کے خلاف موثر نہیں ہے۔Murine RNase inhibitor کا تجربہ RT-PCR، RT-qPCR اور IVT mRNA کے ذریعے کیا گیا تھا، اور یہ مختلف کمرشل ریورس ٹرانسکرپٹیز، DNA پولیمریز اور RNA پولیمریز کے ساتھ مطابقت رکھتا تھا۔
انسانی RNase inhibitors کے مقابلے میں، murine RNase inhibitor میں دو cysteines نہیں ہوتے ہیں جو آکسیکرن کے لیے انتہائی حساس ہوتے ہیں جو روکنے والے کے غیر فعال ہونے کا سبب بنتے ہیں۔جو اسے ڈی ٹی ٹی کی کم ارتکاز (1 ایم ایم سے کم) پر مستحکم بناتا ہے۔یہ خصوصیت اسے ایسے رد عمل میں استعمال کرنے کے لیے موزوں بناتی ہے جہاں DTT کی زیادہ ارتکاز رد عمل کے خلاف ہو (مثلاً ریئل ٹائم RT-PCR)۔
Aدرخواست
اس پروڈکٹ کو کسی بھی تجربے میں وسیع پیمانے پر استعمال کیا جا سکتا ہے جہاں RNA کے انحطاط سے بچنے کے لیے RNase کی مداخلت ممکن ہو، جیسے:
1.cDNA، RT-PCR، RT-qPCR، وغیرہ کے پہلے اسٹرینڈ کی ترکیب۔
2.وٹرو ٹرانسکرپشن/ترجمے کے دوران آر این اے کو انحطاط سے بچاتا ہے (مثال کے طور پر، وٹرو وائرل ریپلیکیشن سسٹم میں)۔
3.RNA علیحدگی اور صاف کرنے کے دوران RNase سرگرمی کی روک تھام۔
ذخیرہ کرنے کی شرائط
پروڈکٹ کو -25～-15 ℃ پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے، جو 2 سال کے لیے درست ہے۔
اسٹوریج بفر
50 mM KCl، 20 mM HEPES-KOH (pH 7.6, 25 ℃)، 8 mM DTT اور 50% گلیسرول۔
یونٹ کی تعریف
5ng ribonuclease A کی سرگرمی کو 50% تک روکنے کے لیے درکار murine RNase inhibitor کی مقدار کو ایک یونٹ (U) کے طور پر بیان کیا گیا تھا۔
پروٹین کا سالماتی وزن
Murine RNase inhibitor کا مالیکیولر وزن 50 kDa ہے۔
کوالٹی کنٹرول
Exonuclease سرگرمی:
1 μg λ -Hind III ڈائجسٹ DNA کے ساتھ 37℃ پر 16 گھنٹے کے لیے 40 U murine RNase inhibitor کوئی انحطاط پیدا نہیں کرتا جیسا کہ ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے طے کیا گیا ہے۔
Endonuclease سرگرمی:
1μg λ DNA کے ساتھ 1μg λ DNA کے ساتھ 40 U 37℃ پر 16 گھنٹے تک کوئی انحطاط پیدا نہیں کرتا جیسا کہ ایگرز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے طے کیا گیا ہے۔
نکنگ سرگرمی:
1μg pBR322 کے ساتھ 1μg pBR322 کے ساتھ 40U 37℃ پر 16 گھنٹے تک کوئی انحطاط پیدا نہیں کرتا جیسا کہ ایگروز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے طے کیا گیا ہے۔
آر نیس سرگرمی:
37℃ پر 4h کے لیے 1.6μg MS2 RNA کے ساتھ murine RNase inhibitor کا 40U کوئی انحطاط پیدا نہیں کرتا جیسا کہ ایگرز جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے طے کیا گیا ہے۔
E.کولی ڈی این اے:
E. coli 16S rRNA لوکس کے لیے مخصوص پرائمر کے ساتھ TaqMan qPCR کا استعمال کرتے ہوئے E. coli جینومک DNA کی موجودگی کے لیے 40 U murine RNase inhibitor کی اسکریننگ کی جاتی ہے۔E. کولی جینومک DNA آلودگی ≤ 0.1 pg/40 U ہے۔
Notes
1. پرتشدد دوغلا پن یا ہلچل انزائم کو غیر فعال کرنے کا باعث بنے گی۔
2. اس روکنے والے کی زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت کی حد 25-55 ℃ تھی، اور اسے 65 ℃ اور اس سے اوپر پر غیر فعال کر دیا گیا تھا۔
3. RNase H، RNase 1 اور RNase T1 کی سرگرمیوں کو murine RNase inhibitor کے ذریعے روکا نہیں گیا تھا۔
4. RNase سرگرمی کی روک تھام pH کی ایک وسیع رینج میں پائی گئی (pH 5-9 سبھی فعال تھے)، اور سب سے زیادہ سرگرمی pH 7-8 میں دیکھی گئی۔
5۔چونکہ رائبونیوکلیز عام طور پر ڈینیچرنگ حالات میں سرگرمی کو برقرار رکھتی ہیں، اس لیے RNase Inhibitor مالیکیولز جو کہ رائبونیوکلیز کے ساتھ پیچیدہ ہو گئے ہیں ان کو ختم کرنے سے بچنے کے لیے احتیاط برتنی چاہیے۔فعال رائبونیوکلیز کے اخراج کو روکنے کے لیے، 50 °C سے زیادہ درجہ حرارت اور یوریا یا دیگر ڈینیچرنگ ایجنٹوں کی زیادہ مقدار سے گریز کرنا چاہیے۔
