ہاٹ سٹارٹ ٹاک ڈی این اے پولیمریز
ہاٹ سٹارٹ ٹاک ڈی این اے پولیمریز (اینٹی باڈی میں ترمیم) تھرمس ایکواٹیکس YT-1 سے ایک ہاٹ سٹارٹ تھرموسٹیبل ڈی این اے پولیمریز ہے، جس میں 5′→3′ پولیمریز سرگرمی اور 5′ فلیپ اینڈونکلیز سرگرمی ہوتی ہے۔ہاٹ سٹارٹ Taq DNA پولیمریز ایک Taq DNA پولیمریز ہے جسے تھرمولابائل Taq اینٹی باڈیز کے ذریعے تبدیل کیا گیا ہے۔اینٹی باڈی میں ترمیم نے PCR کی مخصوصیت، حساسیت اور پیداوار میں اضافہ کیا۔
اجزاء
| جزو | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5×HC Taq بفر | 4×1 ملی لیٹر | 4×10 ملی لیٹر | 4×50 ملی لیٹر | 5×400 ملی لیٹر |
| ہاٹ سٹارٹ ٹاک ڈی این اے پولیمریز (اینٹی باڈی میں ترمیم شدہ) (5 U/μL) | 0.1 ملی لیٹر | 1 ملی لیٹر | 5 ملی لیٹر | 10×5 ملی لیٹر |
درخواستیں
10 mM Tris-HCl (pH 7.4 at 25℃)، 100 mM KCl، 0.1 mM EDTA، 1 mM dithiothreitol، 0.5% Tween20، 0.5% IGEPALCA-630 اور 50% Glycerol۔
اسٹوریج کی حالت
نقل و حمل 0°C سے کم اور -25°C~-15°C پر ذخیرہ کیا جائے۔
یونٹ کی تعریف
ایک یونٹ کو انزائم کی مقدار کے طور پر بیان کیا جاتا ہے جو 75 ° C پر 30 منٹ میں 15 nmol dNTP کو تیزاب میں حل نہ ہونے والے مواد میں شامل کرتا ہے۔
کوالٹی کنٹرول
1.Endonuclease سرگرمی:37℃ پر 4 گھنٹے تک 4 μg pUC19 DNA کے ساتھ 20 U انزائم کے انکیوبیشن کے نتیجے میں جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے طے شدہ ڈی این اے میں کوئی قابل شناخت انحطاط نہیں ہوا۔
2.5 kb لیمبڈا پی سی آر:200 µM dNTPs اور 0.2 µM پرائمرز کی موجودگی میں Taq DNA Polymerase کے 1.25 یونٹوں کے ساتھ 5 ng Lambda DNA کے PCR ایمپلیفیکیشن کے 25 سائیکلوں کا نتیجہ متوقع 5 kb پروڈکٹ میں ہوتا ہے۔
3.Exonuclease سرگرمی:37℃ پر 30 منٹ تک 10 nmol 5´-FAM oligonucleotide کے ساتھ کم از کم 12.5 U Taq DNA Polymerase پر مشتمل 50 µl ردعمل کا انکیوبیشن کوئی قابل شناخت انحطاط نہیں دیتا۔
4.RNase سرگرمی:37°C پر 2 گھنٹے تک RNA ٹرانسکرپٹس کے 1μg کے ساتھ 20 U انزائم پر مشتمل 10 µL رد عمل کے انکیوبیشن کے نتیجے میں جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے طے شدہ RNA کی کوئی قابل شناخت انحطاط نہیں ہوئی۔
5.حرارت کو غیر فعال کرنا:نہیں.
ری ایکشن سسٹم
| اجزاء | حجم |
| ٹیمپلیٹ ڈی این اےa | اختیاری |
| 10 μM فارورڈ پرائمر | 0.5 μL |
| 10 μM ریورس پرائمر | 0.5 μL |
| dNTP مکس (10mM ہر ایک) | 0.5 μL |
| 5×HC Taq بفر | 5 μL |
| طاق ڈی این اے پولیمریزب(5U/μL) | 0.125 μL |
| نیوکلیز سے پاک پانی | 25 μL تک |
نوٹس:
1) ایک
| ڈی این اے | رقم |
| جینومک | 1 ng-1 μg |
| پلازمیڈ یا وائرل | 1 pg-1 ng |
2) ب۔Taq DNA Polymerase کی زیادہ سے زیادہ ارتکاز خصوصی ایپلی کیشنز میں 5-50 یونٹس/mL (0.1-0.5 یونٹس/25 µL ردعمل) تک ہو سکتی ہے۔
تھرمل سائیکلنگ پروٹوکول
پی سی آر
| قدم | درجہ حرارت(°C) | وقت | سائیکل |
| ابتدائی ڈینیچریشنa | 95 ℃ | 1-3 منٹ | - |
| ڈینیچریشن | 95 ℃ | 15-30 سیکنڈ | 30-35 سائیکل |
| اینیلنگب | 45-68 ℃ | 15-60 سیکنڈ | |
| توسیع | 68 ℃ | 1kb/منٹ | |
| حتمی توسیع | 68 ℃ | 5 منٹ | - |
نوٹس:
1) 95 ° C پر 1 منٹ کی ابتدائی ڈینیچریشن زیادہ تر امپلیفیکیشنز کے لیے کافی ہے۔مشکل ٹیمپلیٹس کے لیے، 95 ° C پر 2-3 منٹ کی طویل ڈینیچریشن کی سفارش کی جاتی ہے۔کالونی پی سی آر کے ساتھ، 95 ڈگری سینٹی گریڈ پر ابتدائی 5 منٹ ڈینیچریشن کی سفارش کی جاتی ہے۔
2) اینیلنگ کا مرحلہ عام طور پر 15-60 سیکنڈ ہوتا ہے۔اینیلنگ کا درجہ حرارت پرائمر جوڑے کے Tm پر مبنی ہوتا ہے اور عام طور پر 45-68℃ ہوتا ہے۔
