M-MLV ریورس ٹرانسکرپٹیس
RevScript ریورس ٹرانسکرپٹس جینیاتی انجینئرنگ ٹیکنالوجی کے ذریعے حاصل کیا جاتا ہے۔اس میں اعلیٰ سی ڈی این اے کی ترکیب کی صلاحیت، تھرمل استحکام اور ردعمل درجہ حرارت کی حد (60 ° C تک) ہے۔ترکیب شدہ cDNA پروڈکٹ 10 kb تک ہے۔یہ ٹیمپلیٹس کی وابستگی کو بڑھاتا ہے اور پیچیدہ ثانوی ساخت یا کم کاپی جین والے RNA ٹیمپلیٹس کے ریورس ٹرانسکرپشن کے لیے موزوں ہے۔
اجزاء
| جزو | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript ریورس ٹرانسکرپٹیس (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ملی لیٹر |
| 5 × RevScript بفر | 250 μL | 1.25 ملی لیٹر | 5 ملی لیٹر |
اسٹوریج کی حالت
اس پروڈکٹ کو -25 ° C ~ -15 ° C پر 2 سال تک ذخیرہ کیا جانا چاہئے۔
یونٹ کی تعریف
ایک یونٹ Oligo(dT) کو پرائمر کے طور پر استعمال کرتے ہوئے 10 منٹ میں 37°C پر 1 nmol dTTP کو تیزاب میں حل نہ ہونے والے مواد میں شامل کرتا ہے۔
ری ایکشن سیٹ اپ
1.آر این اے ٹیمپلیٹ کی ڈینیچریشن (یہ مرحلہ اختیاری ہے، آر این اے ٹیمپلیٹ کی ڈینیچریشن ثانوی ڈھانچے کو کھولنے میں مدد کرتی ہے، جو پہلے اسٹرینڈ سی ڈی این اے کی پیداوار کو بہتر بنائے گی۔)
| اجزاء | حجم (μL) |
| RNase مفت ddH2O | 13 تک |
| Oligo (dT)18 (50 μmol/L) یا رینڈم پرائمر (50 μmol/L) یا جین مخصوص پرائمر (2 μmol/L) | 1 |
| یا 1 | |
| یا 1 | |
| آر این اے ٹیمپلیٹ | X a |
نوٹس:
1) a: کل RNA: 1-5 ug یا mRNA: 1-500 ng
2) 65 ° C پر 5 منٹ تک انکیوبٹنگ، پھر 2 منٹ تک ٹھنڈا ہونے کے لیے فوری طور پر برف پر منتقل کریں۔رد عمل کے مائع کو جمع کرنے کے لیے مختصر سینٹرفیوگریشن، ریورس ٹرانسکرپشن ری ایکشن سلوشن شامل کریں جیسا کہ درج ذیل جدول میں دکھایا گیا ہے۔آہستہ سے مکس کرنے کے لئے پائپیٹ۔
1۔رد عمل کے مرکب کی تیاری (20 μL حجم)
| اجزاء | حجم (μL) |
| پچھلے مرحلے کا مرکب | 13 |
| 5×بفر | 4 |
| dNTP مکس (10nmol/L) | 1 |
| ریورس ٹرانسکرپٹیس (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
1.مندرجہ ذیل شرائط کے تحت ردعمل انجام دیں:
| درجہ حرارت (°C) | وقت |
| 25 °Ca | 5 منٹ |
| 42 °Cb | 15-30 منٹ |
| 85 °Cc | 5 منٹ |
نوٹس:
1) ایک25 ° C پر 5 منٹ تک انکیوبٹنگ صرف بے ترتیب ہیکسامرز کے استعمال کے لیے ضروری ہے۔Oligo (dT) کا استعمال کرتے وقت براہ کرم یہ مرحلہ چھوڑ دیں۔18یا جین مخصوص پرائمر۔
2) ب۔تجویز کردہ ریورس ٹرانسکرپشن درجہ حرارت 42 ° C ہے، پیچیدہ ثانوی ڈھانچے یا اعلی GC مواد والے ٹیمپلیٹس کے لیے، رد عمل کا درجہ حرارت 50-55 ° C تک بڑھانے کی سفارش کی جاتی ہے۔
3) ج.ریورس ٹرانسکرپٹیس کو غیر فعال کرنے کے لیے 5 منٹ کے لیے 85°C پر گرم کریں۔
4) پروڈکٹ کو براہ راست پی سی آر یا کیو پی سی آر کے رد عمل میں استعمال کیا جا سکتا ہے، یا قلیل مدتی سٹوریج کے لیے -20 ° C پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے۔طویل مدتی ذخیرہ کرنے کے لیے مصنوعات کو الگ الگ کرنے اور -80 ° C پر اسٹور کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔بار بار جمنے سے گریز کریں۔
5) پروڈکٹ ایک قدمی RT-qPCR کے لیے موزوں ہے، یہ تجویز کیا جاتا ہے کہ ہر 25μL ری ایکشن سسٹم کے لیے 10-20 U ریورس ٹرانسکرپٹس شامل کریں، یا اصل صورتحال کے مطابق بتدریج ریورس ٹرانسکرپٹیس کی مقدار میں اضافہ کریں۔
نوٹس
1.براہ کرم تجرباتی علاقے کو صاف رکھیں؛آپریشن کے دوران صاف دستانے اور ماسک پہننا چاہیے۔RNase آلودگی کو روکنے کے لیے تجربے میں استعمال ہونے والی تمام اشیاء RNase فری ہونی چاہئیں۔
2.آر این اے کے انحطاط کو روکنے کے لیے تمام طریقہ کار کو برف پر انجام دیا جانا چاہیے۔
3.ریورس ٹرانسکرپشن کی اعلی کارکردگی کو یقینی بنانے کے لیے اعلیٰ معیار کے RNA نمونوں کی سفارش کی جاتی ہے۔
4.یہ پروڈکٹ صرف تحقیقی استعمال کے لیے ہے۔
5.براہ کرم اپنی حفاظت کے لیے لیب کوٹ اور ڈسپوزایبل دستانے کے ساتھ کام کریں۔
