RTL ریورس ٹرانسکرپٹیس
RTL ریورس ٹرانسکرپٹ ایک RNA ٹیمپلیٹ پر منحصر DNA پولیمریز ہے جس میں 3'→5' exonuclease سرگرمی نہیں ہے اور RNase H سرگرمی ہے۔یہ انزائم ڈی این اے کے ایک تکمیلی اسٹرینڈ کی ترکیب کے لیے آر این اے کو بطور ٹیمپلیٹ استعمال کر سکتا ہے، جسے فرسٹ اسٹرینڈ سی ڈی این اے کی ترکیب پر لاگو کیا جا سکتا ہے، خاص طور پر RT-LAMP (لوپ میڈیٹیڈ آئیسو تھرمل ایمپلیفیکیشن) کے لیے۔RTL ریورس ٹرانسکرپٹیس 1.0 کے مقابلے میں، حساسیت نمایاں طور پر بہتر ہوئی ہے، تھرمل استحکام مضبوط ہے، اور 65°C پر ردعمل زیادہ مستحکم ہے۔RTL ریورس ٹرانسکرپٹیس (گلیسرول فری) کا استعمال لائوفیلائزڈ تیاریوں، لائوفیلائزڈ RT-LAMP ریجنٹس وغیرہ کو تیار کرنے کے لیے کیا جا سکتا ہے۔
یونٹ کی تعریف
ایک یونٹ پولی(A)•oligo(dT)25 کو ٹیمپلیٹ پرائمر کے طور پر استعمال کرتے ہوئے 50°C پر 20 منٹ میں 1 nmol dTTP کو تیزابی مواد میں شامل کرتا ہے۔
اجزاء
| جزو | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL ریورس ٹرانسکرپٹیس (گلیسرول فری) (15U/μL) | 0.1 ملی لیٹر | 1 ملی لیٹر | 10 ملی لیٹر |
| 10×HC RTL بفر | 1.5 ملی لیٹر | 4×1.5 ملی لیٹر | 5 × 10 ملی لیٹر |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 ملی لیٹر | 2×1.5 ملی لیٹر | 3×10 ملی لیٹر |
اسٹوریج کی حالت
نقل و حمل 0°C سے کم اور -25°C~-15°C پر ذخیرہ کیا جائے۔
کوالٹی کنٹرول
- کی بقایا سرگرمیEndonuclease:ایک 50 μL رد عمل جس میں 1 μg λDNA اور RTL2.0 کے 15 یونٹ ہوتے ہیں جو 37 ℃ پر 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ ہوتے ہیں جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے منفی کنٹرول کے طور پر وہی پیٹرن دکھاتا ہے۔
- کی بقایا سرگرمیExonuclease:ایک 50 μL رد عمل جس میں 1 μg ہند Ⅲ ہضم شدہ λDNA اور RTL2.0 کے 15 یونٹ 37 ℃ پر 16 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے منفی کنٹرول جیسا ہی نمونہ دکھاتا ہے۔
- کی بقایا سرگرمینکیس:ایک 50 μL رد عمل جس میں 1 μg سپر کوائلڈ pBR322 اور RTL2.0 کے 15 یونٹس 37°C پر 4 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے منفی کنٹرول جیسا ہی نمونہ دکھاتا ہے۔
- کی بقایا سرگرمیآر نیس:ایک 10 μL رد عمل جس میں 0.48 μg MS2 RNA اور RTL2.0 کے 15 یونٹس 37°C پر 4 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا جاتا ہے جیل الیکٹروفورسس کے ذریعے منفی کنٹرول جیسا ہی نمونہ دکھاتا ہے۔
- ای کولی gڈی این اے:کے ساتھ ناپاای کولیمخصوص HCD ڈیٹیکشن کٹس，RTL2.0 کے 15 یونٹ 1 سے کم پر مشتمل ہیں۔ای کولیجینوم
ری ایکشن سیٹ اپ
سی ڈی این اے ترکیب پروٹوکول
| اجزاء | حجم |
| ٹیمپلیٹ RNA a | اختیاری |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) یا رینڈم پرائمر مکس (60uM) | 2 μL |
| dNTP مکس (10mM ہر ایک) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL ریورس ٹرانسکرپٹ 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL بفر | 2 μL |
| نیوکلیز سے پاک پانی | 20 μL تک |
نوٹس:
1) کل RNA کی تجویز کردہ خوراک 1ng ~ 1μg ہے۔
2) mRNA کی تجویز کردہ خوراک 50ng ~ 100ng تھی۔
تھرمو-معمول کے لیے سائیکلنگ کی شرائط ردعمل:
| درجہ حرارت (°C) | وقت |
| 25 °Ca | 5 منٹ |
| 55 °C | 10 منٹb |
| 80 °C | 10 منٹ |
نوٹس:
1) اگر رینڈم پرائمر مکس استعمال کیا جاتا ہے تو 25°C پر انکیوبیشن سٹیپ۔
2) اگر ٹارگٹ پرائمر مکس استعمال کیا جاتا ہے تو 10~30 منٹ کے لیے 55°C پر انکیوبیشن مرحلہ۔
RT-LAMP پروٹوکول
| اجزاء | حجم | حتمی ارتکاز |
| ٹیمپلیٹ آر این اے | اختیاری | ≥10 کاپیاں |
| dNTP مکس (10mm) | 3.5 μL | 1.4 ایم ایم |
| FIP/BIP پرائمر (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 پرائمر (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB پرائمر (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/رد عمل |
| RTL ریورس ٹرانسکرپٹ 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/رد عمل |
| Bst V2 DNA پولیمریز (8U/μL) | 1 μL | 8 U/رد عمل |
| MgSO4 (100mm) | 1.5 μL | 6 ایم ایم (کل 8 ایم ایم) |
| 10×HC RTL بفر (یا 10×HC Bst V2 بفر) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| نیوکلیز سے پاک پانی | 25 μL تک | - |
نوٹس:
1) بھنور کے ذریعے مکس کریں اور جمع کرنے کے لیے مختصر طور پر سینٹری فیوج کریں۔1 گھنٹے کے لیے 65 ° C پر درجہ حرارت کا مستقل انکیوبیشن۔
2) دونوں بفر ایک دوسرے سے چلنے کے قابل ہیں اور ان کی ایک ہی ساخت ہے۔
نوٹس
1. یہ پروڈکٹ -20 °C پر ذخیرہ کرنے پر ایک سفید ٹھوس بن جائے گی۔اسے -20 ° C سے باہر نکالیں اور تقریباً 10 منٹ تک برف پر رکھ دیں۔پگھلنے کے بعد اسے ہلا کر اور ملا کر استعمال کیا جا سکتا ہے۔
2. cDNA پروڈکٹ کو -20°C یا -80°C پر ذخیرہ کیا جا سکتا ہے یا PCR کے رد عمل کے لیے فوری طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔
3.RNase آلودگی کو روکنے کے لیے، براہ کرم تجرباتی علاقے کو صاف رکھیں، اور آپریشن کے دوران صاف دستانے اور ماسک پہنیں۔
