ڈی این اے ایکسٹریکشن منی کٹ
یہ کٹ آپٹمائزڈ بفر سسٹم اور سلیکا جیل کالم پیوریفیکیشن ٹیکنالوجی کو اپناتی ہے، جو TAE یا TBE ایگروز جیل کے مختلف ارتکاز سے 70 bp – 20 kb DNA کے ٹکڑوں کو بازیافت کرسکتی ہے۔ڈی این اے جذب کرنے والا کالم خاص طور پر زیادہ نمک والی حالت میں ڈی این اے کو جذب کر سکتا ہے۔اس کے علاوہ، یہ کٹ پی سی آر مصنوعات، انزیمیٹک ری ایکشن سسٹم یا دوسرے طریقوں سے حاصل کردہ خام ڈی این اے پروڈکٹس سے براہ راست ڈی این اے کے ٹکڑوں کو صاف کر سکتی ہے، اور پروٹین، دیگر نامیاتی مرکبات، غیر نامیاتی نمک کے آئنوں اور اولیگونوکلیوٹائڈ پرائمر جیسی نجاست کو دور کر سکتی ہے۔یہ اس بات کا یقین کر سکتا ہے کہ 10-15 منٹ کے اندر صاف کیا جا سکتا ہے.پیوریفائیڈ ڈی این اے کو براہ راست ligation، ٹرانسفارمیشن، انزائم ہاضمہ، ان وٹرو ٹرانسکرپشن، پی سی آر، سیکوینسنگ، مائیکرو انجیکشن وغیرہ کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔
ذخیرہ کرنے کے حالات
-15 ~ -25 ℃ پر اسٹور کریں اور کمرے کے درجہ حرارت پر ٹرانسپورٹ کریں۔
اجزاء
| اجزاء | (100 rxns) |
| بفر جی ڈی پی | 80 ملی لیٹر |
| بفر GW | 2 × 20 ملی لیٹر |
| ایلیوشن بفر | 20 ملی لیٹر |
| فاسٹ پیور ڈی این اے منی کالمز-جی | 100 |
بفر جی ڈی پی:ڈی این اے بائنڈنگ بفر۔
بفر GW:واشنگ بفر؛استعمال سے پہلے بوتل پر اشارہ شدہ حجم کے مطابق مطلق ایتھنول شامل کریں۔
Elution بفر:Elution
فاسٹ پیور ڈی این اے منی کالم-جی:ڈی این اے جذب کرنے والے کالم۔
مجموعہ ٹیوبیں 2 ملی لیٹر:فلٹریٹ کے لیے جمع کرنے والی ٹیوبیں۔
تیار شدہ مواد
1.5 ملی لیٹر جراثیم سے پاک ٹیوبیں، مطلق ایتھنول اور آئسوپروپینول (جب ڈی این اے کا ٹکڑا ≤100 bp، 1 والیوم شامل کریں
isopropanol سے 1 حجم جیل)، پانی کا غسل۔
تجرباتی عمل
Buffer GW کو پتلا کرنے کے لیے 80 ملی لیٹر ایتھنول شامل کریں جیسا کہ استعمال سے پہلے ٹیگ پر اشارہ کیا گیا ہے، کمرے کے درجہ حرارت پر اسٹور کریں۔
میکانزم
1. پی سی آر رد عمل کا حل
جیل نکالنے کی اسکیم: مساوی حجم بفر جی ڈی پی پی سی آر ردعمل حل ریکوری اسکیم شامل کریں:حجم بفر سے 5 گنا اضافہ کریں۔
2. جی ڈی پی جیل کے حجم کا حساب لگائیں (100 μl برابر 100 ملی گرام)
جیل کو تحلیل کریں۔
3. 50 ~ 55 پر پہلے سے گرم کریں۔℃
4. بانڈ واش
بفر GDP کا 300 μL شامل کریں*
بفر GW کا 700 μL شامل کریں۔
بفر GW کا 700 μL شامل کریں۔
5. ایلوٹ
20 - 30μL ایلیوشن بفر یا ڈیونائزڈ پانی شامل کریں۔
نوٹس* اس قدم کے بغیر پی سی آر ری ایکشن فلو ریکوری
جیل نکالنے کا پروگرام
1. ڈی این اے کے ٹکڑوں کو الگ کرنے کے لیے ڈی این اے الیکٹروفورسس کے بعد، یووی لائٹ کے نیچے ایگروز جیل سے ڈی این اے کے ٹکڑے کی ایک پٹی کو ایکسائز کریں۔جیل کی ظاہری نمی کو جذب کرنے کے لیے جاذب کاغذ کا استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے اور جتنا ممکن ہو سکے اضافی ایگروز کو ہٹا کر جیل کے ٹکڑے کے سائز کو کم سے کم کریں۔اس کے حجم کا حساب لگانے کے لیے جیل سلائس (بغیر مائیکرو سینٹرفیوج ٹیوب) کا وزن کریں: 100 ملی گرام جیل سلائس کا حجم تقریباً 100 μL ہے، فرض کرتے ہوئے کہ کثافت 1g/ml ہے۔
2. مساوی حجم بفر جی ڈی پی شامل کریں، 50~55℃ پر 7-10 منٹ تک انکیوبیٹ کریں (جیل کے سائز کے مطابق، جیل مکمل طور پر تحلیل ہونے تک انکیوبیشن کے وقت کو ایڈجسٹ کریں)۔انکیوبیشن کے دوران ٹیوب کو 2 بار الٹ دیں۔
Δ بفر جی ڈی پی کی 1-3 جلدوں کا اضافہ DNA کی بازیابی کی کارکردگی کو متاثر نہیں کرے گا۔اگر ڈی این اے کا ٹکڑا <100 bp بازیافت کرنا ہے تو بفر جی ڈی پی کی 3 جلدیں شامل کرنے کی ضرورت ہے۔جب جیل کا ٹکڑا مکمل طور پر تحلیل ہو جائے تو، آئسوپروپینول کی 1 مقدار شامل کریں اور اچھی طرح مکس کریں، پھر اگلے مرحلے پر جائیں۔
3. نمونے کو ٹیوب کے نیچے لانے کے لیے مختصر طور پر سینٹری فیوج کریں، FastPure DNA Mini Columns-G کو کلیکشن ٹیوب 2 ملی لیٹر میں ڈالیں، احتیاط سے ایک بار زیادہ سے زیادہ 700 μL کے محلول کو منتقل کریں۔
فلٹریشن کالم کا وقت، 30-60 سیکنڈ کے لیے 12,000 rpm (13,800 X g) پر سینٹری فیوج۔
4. فلٹریٹ کو ضائع کریں اور کالم میں 300 μL بفر GDP شامل کریں، کمرے کے درجہ حرارت پر 1 منٹ تک انکیوبیٹ کریں، 30-60 سیکنڈ کے لیے 12,000 rpm (13,800 X g) پر سینٹری فیوج کریں۔
5. فلٹریٹ کو ضائع کریں اور کالم میں 700 μL بفر GW شامل کریں (چیک کریں کہ آیا مطلق ایتھنول پہلے سے شامل کیا گیا ہے!)، 30-60 سیکنڈ کے لیے 12,000 rpm (13,800 X g) پر سینٹری فیوج کریں۔
Δ براہ کرم ادسورپشن کالم کی دیوار کے ارد گرد بفر GW شامل کریں، یا Buffer GW بیک کور شامل کریں اور اسے 2 - 3 بار الٹا مکس کریں تاکہ ٹیوب کی دیوار پر لگنے والے نمک کو مکمل طور پر صاف کرنے میں مدد ملے۔
6. مرحلہ 5 دہرائیں۔
Δ بفر GW کے ساتھ دو بار فلش کرنے سے اس بات کو یقینی بنایا جا سکتا ہے کہ نمک مکمل طور پر ختم ہو جائے اور بعد میں ہونے والے تجربات پر اثرات کو ختم کر دیا جائے۔
7. فلٹریٹ کو ضائع کریں اور خالی کالم کو 12,000 rpm (13,800 X g) پر 2 منٹ کے لیے سینٹری فیوج کریں۔
8. کالم کو صاف 1.5 ملی لیٹر مائیکرو سینٹری فیوج ٹیوب میں داخل کریں، کالم کی جھلی کے بیچ میں 20 - 30 μL ایلیوشن بفر ڈالیں، 2 منٹ کے لیے انکیوبیٹ کریں، اور پھر 12,000 rpm (13,800 X g) پر سینٹری فیوج کریں۔کالم کو ضائع کریں، حاصل شدہ ڈی این اے کو -20 پر محفوظ کریں۔
Δ مرحلہ 8 کے سپرنٹنٹ کو دوبارہ ایلوٹ کرنے کے لیے کالم میں منتقل کرنا اور ایلیوشن بفر کو 55 پر پہلے سے گرم کرنا (جب DNA فریگمنٹ >3 kb) بحالی کی کارکردگی کو بڑھانے میں مددگار ثابت ہو سکتا ہے۔
پی سی آر مصنوعات کی بازیابی کا پروگرام
یہ پروٹوکول پی سی آر مصنوعات، انزیمیٹک ری ایکشن سسٹم اور دیگر ڈی این اے خام مصنوعات (بشمول جینیاتی ڈی این اے) سے ڈی این اے کے ٹکڑوں کو پاک کرنے کے لیے لاگو ہوتا ہے۔یہ محلول مختلف نیوکلیوٹائڈز، پرائمر، پرائمر ڈائمرز، نمک کے مالیکیولز، انزائمز اور دیگر نجاست کو مؤثر طریقے سے دور کر سکتا ہے۔
1. مختصراً سینٹری فیوج PCR مصنوعات، انزیمیٹک ری ایکشن سلوشن، اور دیگر DNA خام مصنوعات۔پائپیٹ سے ان کے حجم کا اندازہ لگائیں اور جراثیم سے پاک 1.5 ملی لیٹر یا 2 ملی لیٹر ٹیوب میں منتقل کریں۔حجم 100 μL تک ddH2O شامل کریں۔جب کہ اعلی ارتکاز کے ساتھ جینومک DNA کے لیے، ddH2O کے ساتھ 300 μL تک پتلا کرنے سے بحالی کی کارکردگی کو بہتر بنانے میں مدد ملے گی۔
2. بفر جی ڈی پی کی 5 جلدیں شامل کریں، الٹی یا بھنور کے ذریعے اچھی طرح مکس کریں۔اگر دلچسپی کا DNA ٹکڑا> 100 bp، ایتھنول کی اضافی 1.5 والیوم (نمونے + بفر GDP) شامل کرنے کی ضرورت ہے۔
3. کالم کو دوبارہ کلیکشن ٹیوب میں داخل کریں، مکسچر کو کالم میں منتقل کریں، 30 – 60 سیکنڈ کے لیے 12,000 rpm (13,800 ×g) پر سینٹری فیوج کریں۔اگر مخلوط محلول کا حجم >700 µL ہے تو، جذب کرنے والے کالم کو دوبارہ جمع کرنے والی ٹیوب میں ڈالیں، باقی محلول کو جذب کرنے والے کالم میں منتقل کریں، اور 30 – 60 سیکنڈ کے لیے 12,000 rpm (13,800 × g) پر سینٹری فیوج کریں۔
4. اگلی کارکردگی سے مراد 08- 1/جیل نکالنے کے پروگرام کا مرحلہ 5 – 8 ہے۔
درخواستیں
TAE یا TBE agarose جیل کی مختلف تعداد؛پی سی آر مصنوعات، انزیمیٹک ری ایکشن سسٹم یا دیگر خام ڈی این اے مصنوعات جو مختلف طریقوں سے حاصل کی جاتی ہیں۔سے برآمد شدہ ٹکڑے70 bp -20 kb
نوٹس
صرف تحقیق کے لیے استعمال کریں۔تشخیصی طریقہ کار میں استعمال کے لیے نہیں۔
1. بفر GW کو پتلا کرنے کے لیے 80 ملی لیٹر ایتھنول شامل کریں جیسا کہ استعمال سے پہلے ٹیگ پر اشارہ کیا گیا ہے، کمرے کے درجہ حرارت پر اسٹور کریں۔
2. اگر کم درجہ حرارت والے اسٹوریج کے دوران بفر جی ڈی پی کو تیز کرنا آسان ہے، تو اسے استعمال سے پہلے کچھ وقت کے لیے کمرے کے درجہ حرارت پر رکھا جا سکتا ہے۔اگر ضروری ہو تو، اسے 37 ℃ پانی کے غسل میں پہلے سے گرم کیا جا سکتا ہے جب تک کہ ورن مکمل طور پر تحلیل نہ ہو جائے، اور پھر اسے مکس کرنے کے بعد استعمال کیا جا سکتا ہے۔
3. پہلے سے غسل کے پانی کا درجہ حرارت 50 ~ 55 ℃ پر سیٹ کریں۔
4. 08-1/جیل نکالنے کے پروگرام کے مرحلے 1 میں، جیل کے ٹکڑوں کے سائز کو کم کرنے سے پگھلنے کے وقت میں نمایاں کمی آئے گی اور بحالی کی کارکردگی میں اضافہ ہو گا (لینیئرائزڈ ڈی این اے ہائیڈولائز کرنے کے لیے آسانی سے ہوتا ہے جب زیادہ درجہ حرارت پر مسلسل ظاہر ہوتا ہے)۔ڈی این اے جیل کو زیادہ دیر تک UV کے سامنے نہ رکھیں، کیونکہ الٹرا وایلیٹ لائٹ ڈی این اے کو نقصان پہنچا سکتی ہے۔
5. جیل کو 08- 1/جیل نکالنے کے پروگرام مرحلہ 2 میں مکمل طور پر تحلیل کریں، بصورت دیگر ڈی این اے کی بازیابی کی کارکردگی شدید متاثر ہوگی۔
6. Elution Buffer یا ddH2O کو 55℃ پر پہلے سے گرم کریں، جو DNA elution کی کارکردگی کو بہتر بنانے میں مددگار ہے۔DNA کو 2.5 mM Tris-HCl، pH 7.0 - 8.5 کے ایلیونٹ میں ذخیرہ کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔
