براہ راست پی سی آر کٹ لگائیں۔
بلی نمبر: HCR2020A
پلانٹ ڈائریکٹ پی سی آر کٹ پودوں کے پتوں، بیجوں وغیرہ کو براہ راست بڑھانے کے لیے موزوں ہے، اور پودوں کے نمونوں کی ہائی تھرو پٹ اسکریننگ کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جن میں پولی سیکرائڈز اور پولی فینول شامل نہیں ہیں۔ڈائریکٹ ایوولوشن پر مبنی ڈائریکٹ ایمپلیفیکیشن ڈی این اے پولیمریز پودوں میں پی سی آر روکنے والوں کے مقابلے میں اعلیٰ رواداری رکھتا ہے۔دریں اثنا، یہ اعلی امپلیفیکیشن کارکردگی کو برقرار رکھتا ہے، جو 5 kb کے اندر ڈی این اے کے ٹکڑوں کو بڑھانے کے لیے موزوں ہے۔کٹ میں موجود منفرد Lysis بفر A کو پودوں کے تازہ یا منجمد ٹشوز کو لیس کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔یہ کام کرنا آسان ہے اور لیسیٹ کو بغیر تزکیہ کے پرورش کے لیے ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔اس نظام میں حفاظتی ایجنٹ ہوتے ہیں جو خام نمونوں کو بار بار جمنے اور پگھلنے کے بعد مؤثر طریقے سے بڑھانے کے قابل بناتے ہیں۔2 × پلانٹ ڈائریکٹ ماسٹر مکس کو ایمپلیفیکیشن ری ایکشن انجام دینے کے لیے صرف پرائمر اور ٹیمپلیٹس کو شامل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے، اس طرح پائپٹنگ آپریشنز کو کم کرنا اور نتائج کا پتہ لگانے اور دوبارہ پیدا کرنے کی صلاحیت میں بہتری آتی ہے۔
اجزاء
| اجزاء | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × پلانٹ ڈائریکٹ ماسٹر مکس | 1.25 ملی لیٹر | 4×1.25 ملی لیٹر |
| پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر اے | 5 ملی لیٹر | 20 ملی لیٹر |
| پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر بی* | 5 ملی لیٹر | 20 ملی لیٹر |
*پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر بی ایک اختیاری ریجنٹ ہے، جس کا استعمال پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر اے کو بے اثر کرنے کے لیے کیا جاتا ہے تاکہ نمونوں کے ذخیرہ کرنے کے وقت کو طول دیا جا سکے۔یہ اصل صورت حال کے مطابق استعمال کیا جا سکتا ہے.
ذخیرہ کرنے کی شرائط
2 × پلانٹ ڈائریکٹ ماسٹر مکس، -30 ~ -15℃ پر اسٹور کریں اور بار بار جمنے اور پگھلنے سے بچیں؛پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر، -30 ~ -15℃ یا 2 ~ 8℃ پر اسٹور کریں۔
تجرباتی عمل
نمونہ پروسیسنگ-پودے کی پتی۔
براہ راست طریقہ:نوجوان پتے استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔ایک چھوٹا اور یکساں نمونہ حاصل کرنے کے لیے 0.5 – 3 ملی میٹر کے مقررہ قطر کے ساتھ سوراخ کا پنچ استعمال کریں، اور پھر نمونے کو براہ راست PCR سسٹم میں شامل کریں (50 μl سسٹم کی سفارش کی جاتی ہے)۔نوٹ، اس بات کو یقینی بنائیں کہ نمونہ PCR محلول میں ہے اور ٹیوب کی دیوار کے خلاف نہیں ہے۔اگر لمبے ٹکڑوں اور پیچیدہ نمونوں کو بڑھانے کے لیے براہ راست پی سی آر کا استعمال کیا جاتا ہے، تو چھوٹے قطر (0.5 – 1 ملی میٹر) کے نمونے کو بطور ٹیمپلیٹ استعمال کرنے سے بہتر نتائج حاصل کرنے میں مدد مل سکتی ہے۔
پیسنے کا طریقہ:نوجوان پتے استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔پتی کا ایک چھوٹا ٹکڑا لیں (تقریباً 1 - 3 ملی میٹر قطر)، اسے 20 μl پلانٹ ڈائریکٹ لیسیز بفر ایب میں رکھیں، اور اسے زیادہ سے زیادہ پیس لیں (یہ مرحلہ 100 μl پائپیٹ ٹپ کے ساتھ پتی کو نچوڑ کر کیا جا سکتا ہے۔ نمونے کو میش کرنے کے لیے)۔اگر پتی کے بافتوں کی بڑی مقدار استعمال کی جاتی ہے (7 ملی میٹر سے زیادہ نہ ہو)، تو ڈیلیشن بفر کے حجم کو 50 μl تک بڑھا دیں۔پتے گرنے کے بعد، محلول سبز نظر آنا چاہیے۔ایک مختصر سینٹرفیوگریشن کے بعد، ایک ری ایکشن ٹیمپلیٹ کے طور پر PCR سسٹم میں 1 μl سپرنٹنٹ شامل کریں۔
تھرمل لیسس کا طریقہ:نوجوان پتے استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔پتی کا ایک چھوٹا ٹکڑا لیں (تقریباً 1 – 3 ملی میٹر قطر)، اسے 20 μl پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر اے میں رکھیں، اور اسے 95 ° C پر 5 – 10 منٹ تک گرم کریں۔لیسز کا وقت مناسب طریقے سے ان پتوں کے لیے بڑھایا جا سکتا ہے جن کو لیس کرنا مشکل ہے (20 منٹ سے زیادہ نہیں)۔اگر پتی کے بافتوں کی بڑی مقدار استعمال کی جائے (7 ملی میٹر سے زیادہ نہ ہو)، تو ڈیلیشن بفر کے حجم کو 50 μl تک بڑھا دیں۔گرم کرنے کے بعد، مختصر طور پر سینٹری فیوج کریں، اور پی سی آر سسٹم میں 1 μl سپرناٹینٹ کو رد عمل کے نمونے کے طور پر شامل کریں۔
نمونہ پروسیسنگ- بیج لگانا
پیسنے کا طریقہ:5 ملی میٹر قطر کے بیجوں کو کاٹنے کے لیے اسکیلپل کا استعمال کریں، انہیں پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر اے کے 100 μl میں شامل کریں، اور نمونے کو پائپیٹ کی نوک یا دیگر اوزاروں سے پیس لیں۔ورٹیکس کو مختصراً اور کمرے کے درجہ حرارت پر 3-5 منٹ تک کھڑے رہنے دیں۔اس بات کو یقینی بنائیں کہ بیج کا نمونہ ڈائلیشن بفر میں ڈوبا ہوا ہے۔ایک مختصر سینٹرفیوگریشن کے بعد، ایک رد عمل کے سانچے کے طور پر PCR سسٹم میں 1 μl سپرنٹنٹ شامل کریں۔
تھرمل لیسس کا طریقہ:5 ملی میٹر قطر کے بیجوں کو کاٹنے کے لیے اسکیلپل کا استعمال کریں، انہیں پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر اے کے 100 μl میں شامل کریں، اور 5-10 منٹ کے لیے 95°C پر گرم کریں۔لیسز کا وقت مناسب طریقے سے ان پتوں کے لیے بڑھایا جا سکتا ہے جن کو لیس کرنا مشکل ہے (30 منٹ سے زیادہ نہیں)۔گرم کرنے کے بعد، مختصر طور پر سینٹری فیوج کریں، اور 1 μl سپرنٹنٹ کو پی سی آر سسٹم میں ری ایکشن ٹیمپلیٹ کے طور پر شامل کریں۔
aمناسب سائز کے نمونے کاٹنے کے لیے کینچی یا دیگر اوزار بھی استعمال کیے جا سکتے ہیں۔اگر مکے یا قینچی کو دوبارہ استعمال کیا جاتا ہے، تو انہیں ہر استعمال سے پہلے 2% سوڈیم ہائپوکلورائٹ محلول سے صاف کیا جانا چاہیے تاکہ نمونوں کے درمیان کراس آلودگی کو روکا جا سکے۔
باس بات کو یقینی بنائیں کہ پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر استعمال کرنے سے پہلے مکمل طور پر پگھل گیا ہے۔اگر بفر چپچپا ہے یا اس میں تیز ہے تو اسے استعمال سے پہلے مکمل طور پر پگھلنے کے لیے 37℃ پر گرم کیا جا سکتا ہے۔
cرد عمل کے نظام میں ٹیمپلیٹ کے حجم کو پلانٹ کے مواد اور ملاوٹ کے حجم میں فرق کے مطابق مناسب طریقے سے ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔
پلانٹ براہ راست Lysis بفر
اس پروڈکٹ میں موجود پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر اے کو زیادہ تر پودوں کے ٹشوز کے جینوم کو جاری کرنے کے لیے سختی سے بہتر بنایا گیا ہے اور یہ 4℃ پر خام پودوں کے قلیل مدتی ذخیرہ کرنے کے لیے موزوں ہے۔اگر نمونے کو طویل عرصے تک ذخیرہ کرنے کی ضرورت ہے (مثال کے طور پر، 1 – 2 ماہ)، تو یہ سفارش کی جاتی ہے کہ سپرنٹنٹ کو ایک نئی EP ٹیوب میں منتقل کریں اور اسے -20℃ پر اسٹور کریں۔نمونوں کو زیادہ مستحکم طریقے سے ذخیرہ کرنے کے لیے، منتقل کیے گئے سپرناٹینٹ میں پلانٹ ڈائریکٹ لائسس بفر بی کے برابر حجم شامل کریں، اچھی طرح مکس کریں اور -20℃ پر اسٹور کریں۔مستحکم اسٹوریج کا وقت پودوں کے نمونوں اور ریاستوں کے ساتھ مختلف ہوتا ہے۔
ری ایکشن سسٹم
| ڈی ڈی ایچ2O | 20.0 μl تک | 50.0 μl تک |
| 2 × پلانٹ ڈائریکٹ ماسٹر مکسa | 10.0 μl | 25.0 µ |
| پرائمر 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| پرائمر 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| پودے کی پتی/خام عرق کا نمونہ(نمونہ پروسیسنگ سے رجوع کریں) | 0.5 – 3 ملی میٹر لیف ڈسک/x µl | 0.5 – 3 ملی میٹر لیف ڈسک/x µl |
aاس میں ایم جی2+2 ایم ایم کی حتمی حراستی میں۔
بہر پرائمر کے لیے 0.4μM کا حتمی ارتکاز استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔پرائمر کا زیادہ استعمال غیر مخصوص امپلیفیکیشن میں اضافہ کا باعث بنے گا۔
cاستعمال شدہ نمونے کی مقدار کو اصل صورت حال کے مطابق ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔خام لیزڈ نمونے کے ایک رد عمل میں استعمال ہونے والی مقدار کو رد عمل کے کل حجم کے 2% - 20% کے درمیان ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔بہت زیادہ نمونوں کا استعمال ایمپلیفیکیشن کی ناکامی کا سبب بن سکتا ہے۔
رد عمل کا پروگرام
| قدم | درجہ حرارت | وقت |
| ابتدائی ڈینیچریشن | 98℃ | 5 منٹ |
| ڈینیچریشن | 95℃ | 10 سیکنڈ |
| اینیلنگ | 58 ~ 72℃ | 15 سیکنڈ |
| توسیع | 72℃ | 30 سیکنڈ |
| حتمی توسیع | 72℃ | 5 منٹ |
aابتدائی ڈینیچریشن (98℃، 5 منٹ) پودوں کے ٹشو کے لیسز کو فروغ دیتا ہے، جینومک ڈی این اے کو جاری کرتا ہے جسے پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔وقت کو کم نہ کریں اور درجہ حرارت کو کم نہ کریں۔
باسے پرائمر Tm قدر کے برابر یا Tm قدر سے 2 ~ 4℃ زیادہ سیٹ کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔اس پروڈکٹ میں استعمال ہونے والا ڈائریکٹ ایمپلیفیکیشن ڈی این اے پولیمریز روایتی Taq DNA پولیمریز سے مختلف ہے، اور ری ایکشن اینیلنگ ٹمپریچر کے لیے خصوصی تقاضے ہیں؛ ہائی اینیلنگ ٹمپریچر کا استعمال غیر مخصوص ایمپلیفیکیشن کو مؤثر طریقے سے کم کر سکتا ہے اور ایمپلیفیکیشن کی کارکردگی کو بہتر بنا سکتا ہے۔پیچیدہ ٹیمپلیٹس کے لیے، اینیلنگ درجہ حرارت کو ایڈجسٹ کرکے اور توسیع کے وقت کو طول دے کر موثر اضافہ حاصل کیا جاسکتا ہے۔
cاگر ایمپلیفیکیشن پروڈکٹ کی لمبائی ≤1 kb ہے، تو توسیع کا وقت 30 سیکنڈ/kb پر سیٹ کیا جاتا ہے۔اگر ایمپلیفیکیشن پروڈکٹ کی لمبائی> 1 kb ہے تو توسیع کا وقت 60 سیکنڈ/kb پر سیٹ کیا جاتا ہے۔
ڈیپیچیدہ نمونوں یا کم امپلیفیکیشن پیداوار والے نمونوں کے لیے، سائیکلوں کی تعداد کو مناسب طور پر 40-50 سائیکل تک بڑھایا جا سکتا ہے۔
درخواستیں
یہ پودوں کے ٹشوز کی براہ راست پرورش اور پودوں کے نمونوں کی ہائی تھرو پٹ اسکریننگ کے لیے لاگو ہوتا ہے جن میں پولی سیکرائڈز اور پولی فینولز شامل نہیں ہوتے ہیں۔
نوٹس
صرف تحقیق کے لیے استعمال کریں۔تشخیصی طریقہ کار میں استعمال کے لیے نہیں۔
1. کروڈ پلانٹ ایمپلیفیکیشن یا ڈائریکٹ ایمپلیفیکیشن کے لیے، تجربہ شروع کرنے سے پہلے پیوریفائیڈ جینومک ڈی این اے کو مثبت کنٹرول کے طور پر استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ سسٹم، پرائمر اور آپریشن درست ہیں۔
2. اس کٹ میں استعمال ہونے والے ڈائریکٹ ایمپلیفیکیشن ڈی این اے پولیمریز میں مضبوط پروف ریڈنگ سرگرمی ہے۔اگر ٹی اے کلوننگ کرنے کی ضرورت ہے تو، ایڈنائن شامل کرنے سے پہلے ڈی این اے کو صاف کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔
3. پرائمر ڈیزائن گائیڈنس:
aیہ تجویز کیا جاتا ہے کہ پرائمر کے 3′ سرے پر آخری بنیاد G یا C ہونی چاہیے۔
بپرائمر کے 3′ اختتام پر آخری 8 اڈوں میں لگاتار مماثلتوں سے گریز کیا جانا چاہیے۔cپرائمر کے 3′ سرے پر ہیئر پین کے ڈھانچے سے پرہیز کریں۔
ڈیفارورڈ پرائمر اور ریورس پرائمر کی Tm ویلیو میں فرق 1℃ سے زیادہ نہیں ہونا چاہیے اور Tm ویلیو کو 60 ~ 72℃ میں ایڈجسٹ کیا جانا چاہیے (Tm ویلیو کا حساب لگانے کے لیے پرائمر پریمیئر 5 کی سفارش کی جاتی ہے)۔
eاضافی اضافی پرائمر ترتیب جو ٹیمپلیٹ کے ساتھ مماثل نہیں ہیں، پرائمر Tm قدر کا حساب لگاتے وقت شامل نہیں کیا جانا چاہیے۔
fیہ تجویز کیا جاتا ہے کہ پرائمر کا GC مواد 40% -60% ہو۔
جیپرائمر میں A, G, C اور T کی مجموعی تقسیم ہر ممکن حد تک یکساں ہونی چاہیے۔اعلی GC یا AT مواد والے علاقوں کے استعمال سے گریز کریں۔
hپرائمر کے اندر یا دو پرائمر کے درمیان 5 یا اس سے زیادہ بیسز کے تکمیلی سلسلے کی موجودگی سے گریز کریں اور دو پرائمر کے 3′ سرے پر 3 یا اس سے زیادہ بیسز کے تکمیلی سلسلے کی موجودگی سے گریز کریں۔
میں.غیر مخصوص امپلیفیکیشن کو روکنے کے لیے پرائمر کی خصوصیت کو جانچنے کے لیے NCBI BLAST فنکشن کا استعمال کریں۔
