2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
بلی نمبر: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) کو DNA نکالنے یا نمونے کی تیاری کے بغیر نمونوں سے براہ راست PCR انجام دینے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔یہ ریجنٹ ہاٹ سٹارٹ DNA پولیمریز، uracil DNA glycosylase (UNG)، RNase Inhibitor، MgCl پر مشتمل ہوتا ہے۔2، dNTPs (dTTP کی بجائے dUTP کے ساتھ)، اور سٹیبلائزرز، مقداری PCR (qPCR) کے لیے۔یہ ریجنٹ اعلیٰ روک تھام کرنے والی رواداری کو پیش کرتا ہے، اور اس طرح اسے براہ راست نمونوں کی کھوج پر لگایا جا سکتا ہے جیسے گلے کے جھاڑو، تھوک، اینٹی جمنے والے پورے خون، پلازما، اور سیرم کو بغیر ڈی این اے نکالے۔ریجنٹ اینٹی انحیبیٹری ڈی این اے پولیمریز اور UNG انزائم کے مخلوط خامروں کے ساتھ qPCR کے لیے ملکیتی بفر کا استعمال کرتا ہے۔لہذا، یہ انابیٹرز پر مشتمل نمونوں میں ہدف کے جینوں کی ایک اچھی پرورش حاصل کر سکتا ہے اور PCR بقایا اور ایروسول آلودگی کی وجہ سے ہونے والی غلط مثبت پرورش کو روک سکتا ہے۔یہ ریجنٹ زیادہ تر فلوروسینٹ مقداری پی سی آر آلات کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے، جیسے کہ اپلائیڈ بایو سسٹم، ایپینڈورف، بائیو ریڈ، روشے وغیرہ۔
اجزاء
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG مکس
2. 2×SensiDirect پریمکس بفر (dUTP)
ذخیرہ کرنے کے حالات
تمام اجزاء کو طویل مدتی اسٹوریج کے لیے -20℃ اور 3 ماہ تک 4℃ پر رکھا جانا چاہیے۔براہ کرم استعمال کرنے سے پہلے پگھلنے اور سینٹرفیوج کے بعد اچھی طرح مکس کریں۔بار بار جمنے سے گریز کریں۔
سائیکلنگ پروٹوکول
| قدم | درجہ حرارت | وقت | سائیکل |
| ہاضمہ | 50℃ | 2 منٹ | 1 |
| پولیمریز ایکٹیویشن | 95℃ | 1-5 منٹ | 1 |
| ڈینیچر | 95℃ | 10-20s | 40-50 |
| اینیلنگ/توسیع | 56-64℃ | 20-60 کی دہائی |
پائپٹنگ کی ہدایات
| ریجنٹ | حجم فی ردعمل | حجم فی رد عمل | حتمی ارتکاز |
| 2×SensiDirect پریمکس بفر (dUTP) | 12.5µL | 25µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG مکس | 0.5µL | 1µL | 1× |
| 25×پرائمر پروب مکس1، 2 | 1µL | 2µL | 1× |
| نمونہ3، 4 | - | - | - |
| ڈی ڈی ایچ2O | - | - | - |
| مکمل حجم | 25 μL | 50 μL | - |
1. پرائمر کا حتمی ارتکاز عام طور پر 0.2μM ہوتا ہے۔بہتر نتائج کے لیے، پرائمر کی حراستی کو 0.2-1μM کی حد کے اندر بہتر بنایا جا سکتا ہے۔
2. عام طور پر، تحقیقاتی ارتکاز کو 0.1-0.3μM کی حد کے اندر بہتر بنایا جا سکتا ہے۔پروب کی زیادہ سے زیادہ ارتکاز کا تعلق ریئل ٹائم پی سی آر ایمپلیفیکیشن انسٹرومنٹ، پروب کی قسم، اور فلوروسینٹ لیبلنگ مادہ کی قسم سے ہے۔براہ کرم انسٹرومنٹ مینوئل یا ہر فلوروسینٹ پروب کی مخصوص ضروریات کو دیکھیں۔
3. مختلف قسم کے نمونوں میں مختلف اقسام اور انابائٹر کا مواد اور ٹارگٹ جین کا کاپی نمبر ہوتا ہے۔نمونے کے حجم کو اصل حالت کے مطابق سمجھا جانا چاہئے۔اگر ضروری ہو تو نیوکلیز فری پانی یا ٹی ای بفر شامل کرکے نمونے کو کم کریں۔
4. مختلف نمونوں کا تجویز کردہ حجم:
| نمونہ | ایک 50 کے لیے والیوم μL ردعمل | زیادہ سے زیادہ تناسب |
| اینٹی کوگولیٹڈ سارا خون | 2.5 μL | 5% |
| پلازما | 15 μL | 30% |
| سیرم | 10 μL | 20% |
| گلے کا جھاڑو | 10 μL | 20% |
| تھوک | 10 μL | 20% |
کوالٹی کنٹرول
1. فنکشن کا پتہ لگانا: کیو پی سی آر کی حساسیت، مخصوصیت اور تکرار کی صلاحیت۔
2. کوئی exogenous nuclease سرگرمی نہیں: exogenous endonuclease اور exonuclease آلودگی نہیں۔
پروڈکٹ کے نوٹس
1. اس پروڈکٹ میں ہاٹ سٹارٹ ڈی این اے پولیمریز کی ایک نئی قسم کا استعمال کیا گیا ہے، جسے 1-5 منٹ میں فعال کیا جا سکتا ہے۔ چونکہ اس کے رد عمل کے بفر کو بہتر بنایا گیا ہے، یہ پروب طریقہ استعمال کرتے ہوئے ڈبل یا ایک سے زیادہ فلوروسینس مقداری PCR کے لیے زیادہ موزوں ہے۔
2. اگر پی سی آر ایمپلیفیکیشن کی آر این ویلیو بہت کم ہے یا ایمپلیفیکیشن کو ظاہری طور پر روکا گیا ہے، نمونے کی مقدار میں کمی، رد عمل کی مقدار میں اضافہ یا نمونے کے پچھلے کم ہونے سے نتائج بہتر ہو سکتے ہیں۔
3. خون، تھوک، پیشاب، گلے کے جھاڑو وغیرہ کو جمع کرنا طبی معیار کے تقاضوں پر عمل کرنا چاہیے، اور نیوکلک ایسڈ کے انحطاط کو روکنے کے لیے تازہ نمونہ استعمال کیا جا سکتا ہے۔
4. چونکہ مختلف amplicons میں dUTP کے لیے مختلف استعمال کی کارکردگی اور UNG کے لیے حساسیت ہوتی ہے، اگر UNG سسٹم کا استعمال کرتے وقت پتہ لگانے کی حساسیت کم ہو جائے تو ری ایجنٹس کو بہتر بنایا جانا چاہیے۔اگر ضرورت ہو تو تکنیکی مدد کے لیے ہم سے رابطہ کریں۔
5. ایک قدمی رد عمل کے درمیان کیری اوور پی سی آر پروڈکٹس کے ایمپلیفیکیشن سے بچنے کے لیے، ایمپلیفیکیشن کے لیے مخصوص تجرباتی علاقے اور پائپیٹ کی ضرورت ہے۔دستانے کے ساتھ چلائیں اور بار بار تبدیل کریں اور پی سی آر ایمپلیفیکیشن کے بعد ری ایکشن ٹیوب کو نہ کھولیں۔
