پروٹینیز K mNGS (مائع)
پروٹیناز K ایک مستحکم سیرین پروٹیز ہے جس میں وسیع سبسٹریٹ مخصوصیت ہے۔یہ ڈٹرجنٹ کی موجودگی میں بھی مقامی حالت میں بہت سے پروٹین کو خراب کر دیتا ہے۔کرسٹل اور مالیکیولر اسٹرکچر اسٹڈیز کے شواہد سے پتہ چلتا ہے کہ انزائم کا تعلق سبٹیلیسن فیملی سے ہے جس میں ایک فعال سائٹ کیٹلیٹک ٹرائیڈ (Asp39-اس کا69-سر224)۔کلیویج کی بنیادی جگہ پیپٹائڈ بانڈ ہے جو الیفاٹک اور آرومیٹک امینو ایسڈ کے کاربوکسائل گروپ سے ملحق ہے جس میں بلاک شدہ الفا امینو گروپس ہیں۔یہ عام طور پر اس کی وسیع خصوصیات کے لیے استعمال ہوتا ہے۔یہ پروٹینیز K خاص طور پر mNGS کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے۔دوسرے پروٹینیز K کے مقابلے میں، اس میں اسی انزیمیٹک کارکردگی کے ساتھ نیوکلک ایسڈ کی آلودگی بھی کم ہوتی ہے، جو نیچے کی طرف ایم این جی ایس کے اطلاق کو بہتر طور پر یقینی بنا سکتی ہے۔
ذخیرہ کرنے کی شرائط
2 سال کے لیے 2-8℃
تفصیلات
| ظہور | بے رنگ سے ہلکا بھورا مائع |
| سرگرمی | ≥800 U/ml |
| پروٹین کا ارتکاز | ≥20 ملی گرام/ملی لیٹر |
| نکیس | کوئی پتہ نہیں چلا |
| ڈی نیس | کوئی پتہ نہیں چلا |
| آر نیس | کوئی پتہ نہیں چلا |
پراپرٹیز
| ای سی نمبر | 3.4.21.64(Tritirachium البم سے ریکومبیننٹ) |
| آئیسو الیکٹرک پوائنٹ | 7.81 |
| بہترین پی ایچ | 7.0- 12.0 تصویر 1 |
| زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت | 65 ℃ تصویر 2 |
| پی ایچ استحکام | پی ایچ 4.5- 12.5 (25 ℃، 16 h) تصویر 3 |
| تھرمل استحکام | 50 ℃ سے نیچے (pH 8.0، 30 منٹ) تصویر 4 |
| اسٹوریج استحکام | 25 ℃ پر 12 ماہ کے لیے 90% سے زیادہ سرگرمی |
| ایکٹیوٹرز | ایس ڈی ایس، یوریا |
| روکنے والے | ڈائیسوپروپل فلورو فاسفیٹ؛phenylmethylsulfonyl فلورائڈ |
درخواستیں
1. جینیاتی تشخیصی کٹ
2. آر این اے اور ڈی این اے نکالنے کی کٹس
3. ٹشوز سے غیر پروٹین اجزاء کا اخراج، پروٹین کی نجاستوں کا انحطاط، جیسے ڈی این اےویکسین اور ہیپرین کی تیاری
4. pulsed electrophoresis کے ذریعے کروموسوم DNA کی تیاری
5. مغربی دھبہ
6. وٹرو تشخیص میں انزیمیٹک گلائکوسلیٹڈ البومن ری ایجنٹس
احتیاطی تدابیر
استعمال کرتے وقت یا وزن کرتے وقت حفاظتی دستانے اور چشمیں پہنیں، اور استعمال کے بعد اچھی طرح ہوادار رکھیں۔یہ پروڈکٹ جلد کی الرجک ردعمل اور آنکھوں میں شدید جلن کا سبب بن سکتی ہے۔اگر سانس لیا جائے تو یہ الرجی یا دمہ کی علامات یا ڈسپنیا کا سبب بن سکتا ہے۔سانس کی جلن کا سبب بن سکتا ہے۔
یونٹ کی تعریف
ایک یونٹ (U) کو 1 μmol پیدا کرنے کے لیے کیسین کو ہائیڈولائز کرنے کے لیے درکار انزائم کی مقدار کے طور پر بیان کیا گیا ہے۔ٹائروسین فی منٹ درج ذیل شرائط کے تحت۔
ری ایجنٹس کی تیاری
ریجنٹ I: 1 گرام دودھ کیسین کو 0.1M سوڈیم فاسفیٹ محلول (pH 8.0) کے 50ml میں تحلیل کیا گیا، 65-70 ℃ پانی میں 15 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا، ہلایا اور تحلیل کیا گیا، پانی سے ٹھنڈا کیا گیا، سوڈیم ہائیڈرو آکسائیڈ کے ذریعے pH 8.0 کے حجم میں ایڈجسٹ کیا گیا۔ 100 ملی لیٹر
ریجنٹ II: 0.1M ٹرائکلورواسیٹک ایسڈ، 0.2M سوڈیم ایسیٹیٹ، 0.3M ایسیٹک ایسڈ۔
ریجنٹ III: 0.4M Na2CO3حل
ریجنٹ IV: فورینٹ ریجنٹ کو 5 بار خالص پانی سے ملایا جاتا ہے۔
ریجنٹ V: انزائم ڈیلوئنٹ: 0.1M سوڈیم فاسفیٹ محلول (pH 8.0)۔
ریجنٹ VI: ٹائروسین محلول: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosine 0.2 کے ساتھ تحلیلایم ایچ سی ایل
طریقہ کار
1. 0.5 ملی لیٹر ریجنٹ I کو 37 ℃ پر پہلے سے گرم کیا جاتا ہے، اس میں 0.5 ملی لیٹر انزائم محلول شامل کریں، اچھی طرح مکس کریں، اور انکیوبیٹ کریں۔37 ℃ 10 منٹ کے لیے۔
2. رد عمل کو روکنے کے لیے 1 ملی لیٹر ریجنٹ II شامل کریں، اچھی طرح مکس کریں، اور 30 منٹ تک انکیوبیشن جاری رکھیں۔
3. Centrifugate رد عمل کا حل.
4. 0.5 ملی لیٹر سپرناٹینٹ لیں، 2.5 ملی لیٹر ریجنٹ III، 0.5 ملی لیٹر ریجنٹ IV شامل کریں، اچھی طرح مکس کریں اور 37 ℃ پر انکیوبیٹ کریں۔30 منٹ کے لیے
5. او ڈی660OD کے طور پر طے کیا گیا تھا۔1;خالی کنٹرول گروپ: 0.5 ملی لیٹر ریجنٹ V انزائم کو تبدیل کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔OD کا تعین کرنے کا حل660OD کے طور پر2، ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tyrosine معیاری وکر: 0.5mL مختلف ارتکاز L-tyrosine محلول، 2.5mL ریجنٹ III، 5mL سینٹری فیوج ٹیوب میں 0.5mL ریجنٹ IV، 37℃ میں 30 منٹ تک انکیوبیٹ کریں، OD کا پتہ لگائیں۔660L-tyrosine کے مختلف ارتکاز کے لیے، پھر معیاری وکر Y=kX+b حاصل کیا، جہاں Y L-tyrosine کا ارتکاز ہے، X OD ہے600.
حساب کتاب
2: رد عمل کے حل کا کل حجم (mL)
0.5: انزائم محلول کا حجم (mL)
0.5: کروموجینک تعیین (mL) میں استعمال ہونے والے رد عمل کا مائع حجم
10: رد عمل کا وقت (منٹ)
Df: dilution ایک سے زیادہ
C: انزائم کا ارتکاز (mg/mL)
حوالہ جات
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972)؛23:77۔
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.بائیوفیس۔Res.کمیون(1971)؛44:513۔
3. ہلز، ایچ.ET رحمہ اللہ تعالی.،یورجے بائیو کیم۔(1975)؛56:103–108۔
4. سمبروک جےet al. مالیکیولر کلوننگ: ایک لیبارٹری دستی، دوسرا ایڈیشن، کولڈ اسپرنگ ہاربرلیبارٹری پریس، کولڈ اسپرنگ ہاربر (1989)۔
اعداد و شمار
انجیر.1 زیادہ سے زیادہ pH
100 ملی میٹر بفر حل: پی ایچ 6.0-8.0، نا فاسفیٹ؛pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5، Glycine-NaOH. Enzyme ارتکاز: 1mg/mL
تصویر 2 بہترین درجہ حرارت
20 ایم ایم کے فاسفیٹ بفر پی ایچ 8.0 میں رد عمل۔انزائم کی حراستی: 1 ملی گرام/ملی لیٹر
تصویر 3 پی ایچ استحکام
25 ℃، 50 mM بفر حل کے ساتھ 16 h-علاج: pH 4.5- 5.5، Acetate;پی ایچ 6.0-8.0، نا فاسفیٹ؛pH 8.0-9.0، Tris-ایچ سی ایلpH 9.0- 12.5، Glycine-NaOH۔انزائم کی حراستی: 1 ملی گرام/ملی لیٹر
تصویر 4 تھرمل استحکام
50 mM Tris-HCl بفر کے ساتھ 30 منٹ کا علاج، pH 8.0۔انزائم کی حراستی: 1 ملی گرام/ملی لیٹر
تصویر 5 اسٹوریج استحکامty at 25℃
