وائلڈ ٹاک ڈی این اے پولیمریز
Taq DNA Polymerase Thermus aquaticus YT-1 سے ایک تھرموسٹیبل DNA پولیمریز ہے، جس میں 5′→3′ پولیمریز سرگرمی اور 5´ فلیپ اینڈونکلیز سرگرمی ہوتی ہے۔
اجزاء
| جزو | HC1010A-01 | HC1010A-02 | HC1010A-03 | HC1010A-04 |
| 10× طاق بفر | 2 × 1 ملی لیٹر | 2 × 10 ملی لیٹر | 2×50 ملی لیٹر | 5×200 ملی لیٹر |
| Taq DNA پولیمریز (5 U/μL) | 0.1 ملی لیٹر | 1 ملی لیٹر | 5 ملی لیٹر | 5 × 10 ملی لیٹر |
اسٹوریج کی حالت
نقل و حمل 0°C سے کم اور -25°C~-15°C پر ذخیرہ کیا جائے۔
یونٹ کی تعریف
ایک یونٹ کو انزائم کی مقدار کے طور پر بیان کیا جاتا ہے جو 75 ° C پر 30 منٹ میں 15 nmol dNTP کو تیزاب میں حل نہ ہونے والے مواد میں شامل کرتا ہے۔
کوالٹی کنٹرول
1.پروٹین پیوریٹی پرکھ (SDS-PAGE):Taq DNA پولیمریز کی پاکیزگی ≥95% SDS-PAGE تجزیہ کے ذریعہ طے کی گئی تھی۔
2.Endonuclease سرگرمی:37 ℃ پر 16 گھنٹے کے لیے 1 μg λDNA کے ساتھ کم از کم 5 U Taq DNA پولیمریز کا تعین کے مطابق کوئی قابل شناخت انحطاط نہیں ہوتا ہے۔
3.Exonuclease سرگرمی:1 μg λ -Hind Ⅲ DNA کو 16 گھنٹے کے لیے 37 ℃ پر کم از کم 5 U Taq DNA پولیمریز کا تعین کرنے کے نتیجے میں کوئی قابل شناخت انحطاط نہیں ہوتا ہے۔
4.نکیس سرگرمی:1 μg pBR322 DNA کے ساتھ کم از کم 5 U Taq DNA پولیمریز 16 گھنٹے 37 ° C پر نتیجہ کے مطابق کوئی قابل شناخت انحطاط نہیں ہوتا ہے۔
5.RNase سرگرمی:1.6 μg MS2 RNA کے ساتھ کم از کم 5 U Taq DNA پولیمریز 16 گھنٹے کے لیے 37°C پر نتیجہ کے مطابق کوئی قابل شناخت انحطاط نہیں ہوتا۔
6.ای کولیڈی این اے:Taq DNA پولیمریز کا 5 U E. coli genomic DNA کی موجودگی کے لیے TaqMan qPCR کا استعمال کرتے ہوئے E. coli 16S rRNA لوکس کے لیے مخصوص پرائمر کے ساتھ اسکرین کیا جاتا ہے۔ای کولی جینومک ڈی این اے آلودگی ≤1 کاپی ہے۔
7.پی سی آر ایمپلیفیکیشن (5.0 کے بی لیمبڈا ڈی این اے)- ایک 50 µL رد عمل جس میں 5 این جی لیمبڈا ڈی این اے کے ساتھ 5 یونٹ تاق ڈی این اے پولیمریز PCR ایمپلیفیکیشن کے 25 چکروں کے لیے متوقع 5.0 kb پروڈکٹ کا نتیجہ ہوتا ہے۔
ری ایکشن سیٹ اپ
| اجزاء | حجم |
| ٹیمپلیٹ ڈی این اےa | اختیاری |
| 10 μM فارورڈ پرائمر | 1 μL |
| 10 μM ریورس پرائمر | 1 μL |
| dNTP مکس (10mM ہر ایک) | 1 μL |
| 10×طاق بفر | 5 μL |
| طاق ڈی این اے پولیمریزب | 0.25 μL |
| نیوکلیز سے پاک پانی | 50 μL تک |
نوٹس:
1) مختلف ٹیمپلیٹس کا بہترین ردعمل کا ارتکاز مختلف ہے۔مندرجہ ذیل جدول 50 µL ردعمل کے نظام کے تجویز کردہ ٹیمپلیٹ کے استعمال کو دکھاتا ہے۔
| ڈی این اے | رقم |
| جینومک | 1 ng-1 μg |
| پلازمیڈ یا وائرل | 1 pg-1 ng |
2) خاص ایپلی کیشنز میں Taq DNA پولیمریز کی زیادہ سے زیادہ ارتکاز 0.25 µL~1 µL تک ہو سکتی ہے۔
رد عملپروگرام
| قدم | درجہ حرارت(°C) | وقت | سائیکل |
| ابتدائی ڈینیچریشنa | 95 ℃ | 5 منٹ | - |
| ڈینیچریشن | 95 ℃ | 15-30 سیکنڈ | 30-35 سائیکل |
| اینیلنگب | 60 ℃ | 15 سیکنڈ | |
| توسیع | 72 ℃ | 1kb/منٹ | |
| حتمی توسیع | 72 ℃ | 5 منٹ | - |
نوٹس:
1) ابتدائی ڈینیچریشن حالت زیادہ تر ایمپلیفیکیشن ری ایکشنز کے لیے موزوں ہے اور ٹیمپلیٹ کی ساخت کی پیچیدگی کے مطابق اس میں ترمیم کی جا سکتی ہے۔اگر ٹیمپلیٹ کا ڈھانچہ پیچیدہ ہے، تو ڈینیچریشن سے پہلے کا وقت 5 - 10 منٹ تک بڑھایا جا سکتا ہے تاکہ ابتدائی ڈینیچریشن اثر کو بہتر بنایا جا سکے۔
2) اینیلنگ درجہ حرارت کو پرائمر کی Tm قدر کے مطابق ایڈجسٹ کرنے کی ضرورت ہے، جو عام طور پر پرائمر کی Tm قدر سے 3~5 ℃ کم پر سیٹ کیا جاتا ہے۔پیچیدہ ٹیمپلیٹس کے لیے، اینیلنگ درجہ حرارت کو ایڈجسٹ کرنا اور موثر امپلیفیکیشن حاصل کرنے کے لیے توسیع کا وقت بڑھانا ضروری ہے۔
